1. 引言
痛风性关节炎(Gouty Arthritis, GA)是一种由多种因素造成的疾病，其发病主要原因是体内尿酸代谢紊乱以及其他原因导致的尿酸升高，引发尿酸单钠晶体(monosodium urate, MSU)沉积于关节滑液和软骨中，引起痛风发作[1]。据报道我国成年居民高尿酸血症患病率约为14%，痛风患病率为0.86%~2.20%，而在痛风性患者中GA的发病率高达80%以上[2]。GA的反复发作会导致痛风石的形成，导致关节畸形和关节损伤，以及工作效率低下和生活质量下降[3]。临床上常用于治疗痛风性关节炎的药物秋水仙碱、非甾体抗炎药以及糖皮质激素类药物等，通常无法获得令人满意的治疗效果，甚至还会发生严重的肝肾功能损伤等副作用[4]。
余甘子又名山油柑、余甘果、望果、鱼木果、土橄榄等，为大戟科叶下珠属植物余甘子(Phyllanthus emblica L.)的成熟果实[5]。在古籍《异物志》《本草拾遗》《千金翼方》《新修本草》等中早就有对余甘子的记载，而在李时珍《本草纲目》中更加表明了对余甘子清热解毒、延年益寿价值的肯定[6]。有研究显示余甘子具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血脂、降血糖等药理作用[7]。有研究表明，藏药余甘子的粗提取物能够明显抑制MDA-MB-231细胞的生长和迁移，余甘子具有抗三阴乳腺癌的效果[8]。在以汉防己甲素为阳性对照的矽肺小鼠实验中，余甘子的醇提取物可以抑制小鼠肺纤维化[9]。现在也有研究显示余甘子的提取物对肝细胞具有保护作用，在抗肝纤维化、抗病毒性肝炎、抗非酒精性脂肪肝、抗肝癌方面都具有防治效果[10]。付晓辉等[11]用大鼠和小鼠的高尿酸模型的药效学实验表明余甘子具有降低血尿酸水平、抑制痛风性炎症、镇痛等作用，为治疗痛风性关节炎提供了新思路。余甘子单药制剂目前用于利咽止痛，并没有用于治疗上述疾病的单独制剂。
采用网络药理学的方法，分析余甘子治疗痛风性关节炎的治疗作用，探讨余甘子治疗痛风性关节炎的潜在机制，从而为深入研究余甘子治疗痛风性关节炎提供参考。
2. 数据库与软件
本文所用软件及在线数据库网址，见表1。
Table 1. The database address used in this article
表1. 本文所用数据库地址
3. 方法
3.1. 余甘子有效成分及靶点筛选
根据最新发表的《网络药理学评选方法指南》进行后续的网络药理学分析[12]。在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)中检索“余甘子”，利用TCMSP数据库中的数据综合分析余甘子的成分、靶点及ADME (吸收、分布、代谢、排泄)性质及相关信息[13]，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和类药性指数(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为条件进行筛选后，得到余甘子中符合条件的有效成分。再利用Pubchem库查询余甘子有效成分的简化分子线性输入规范(simplified molecular input line entry system, SMILES)或结构数据文件(structure date format, SDF)，并在Swiss Target Prediction库、Super-PRED库和PharmMapper库中预测其靶点。为方便后续操作顺利进行，需将靶点蛋白统一转换为基因名(gene name)，利用UniProt库查询后统一规范，最后再利用Excel梳理去重，构建余甘子的“药物–成分–靶点”数据库。
3.2. 痛风性关节炎疾病基因靶点筛选
检索DisGeNeT数据库，检索关键词为“Gouty Arthritis”，以物种“Homo Sapiens”为筛选条件，筛选实验研究验证的与痛风性关节炎相关的疾病基因，检索结果用Excel汇总并去重后得到疾病靶点数据库。
3.3. 蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Networks, PPI)，
并构建余甘子化学成分–痛风–靶点网络图
利用Venny2.1.0将筛选得到的有效成分相关靶点和疾病靶点取交集，并绘制韦恩图。构建与核心靶点筛选PPI可将靶点间的相互关系进行可视化，直观表达各靶点在痛风防治中的相互作用。将交集靶点输入String数据库，限定物种为“Homo Sapiens”，交互可信度设置为0.4，其他参数为默认值，去除游离靶点，获取PPI网络关系。利用Cytoscape 3.9.1软件构建药物–成分–疾病–靶点网络图，根据Degree值大小筛选得到核心靶点，颜色深浅(颜色越深Degree值越大、该靶点越重要，颜色越浅Degree值越小)。
3.4. 基因本体(Gene Ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析
将痛风性关节炎和余甘子的基因交集导入DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析，对前20条通路在Cytoscape 3.9.1软件进行可视化分析。
4. 结果
4.1. 活性成分及靶点筛选结果
通过TCMSP数据库检索余甘子的化学成分，以OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18为标准筛选化学成分，筛选获得有效化学成分18个。见表2。经过标准化处理及删除重复项后得到药物靶点1304个。
Table 2. Collection and screening of chemical components and targets of Phyllanthus emblica (oral bioavailability ≥ 30%, drug-like property ≥ 0.18)
表2. 余甘子的化学成分及靶点收集与筛选(口服生物利用度 ≥ 30%，类药性 ≥ 0.18)
编码 |
成分名称 |
口服生物
利用度 |
类药性 |
中药 |
MOL006806 |
Phyllanemblinin A |
72.44 |
0.33 |
余甘子 |
MOL006826 |
chebulic acid |
72 |
0.32 |
余甘子 |
MOL000569 |
digallate |
61.85 |
0.26 |
余甘子 |
MOL006821 |
(−)-epigallocatechin-3-gallate |
55.09 |
0.77 |
余甘子 |
MOL000492 |
(+)-catechin |
54.83 |
0.24 |
余甘子 |
MOL006796 |
mucic acid 1,4-lactone 5-0-gallate |
52.26 |
0.27 |
余甘子 |
MOL006793 |
mucic acid 1,4-lactone 2-0-gallate |
49.56 |
0.31 |
余甘子 |
MOL006799 |
(2S,3R,3aS,4R,4'S,5'R,6S,7aR)-3,4,4'-trihydroxy-3,5'-bis(hydroxymethyl)spiro[3a,4,5,6,7,7a-hexahydrobenzofuran-2,2'-tetrahydropyran]-6-carboxylic acid |
48.46 |
0.31 |
余甘子 |
MOL000098 |
quercetin |
46.43 |
0.28 |
余甘子 |
MOL006802 |
phyllaemblicin A |
45.63 |
0.77 |
余甘子 |
MOL005983 |
leucodelphinidin |
43.45 |
0.31 |
余甘子 |
MOL006801 |
phyllaemblicacid methyl ester |
43.09 |
0.73 |
余甘子 |
MOL001002 |
ellagic acid |
43.06 |
0.43 |
余甘子 |
MOL000422 |
kaempferol |
41.88 |
0.24 |
余甘子 |
MOL006824 |
α-amyrin |
39.51 |
0.76 |
余甘子 |
MOL000358 |
beta-sitosterol |
36.91 |
0.75 |
余甘子 |
MOL000006 |
luteolin |
36.16 |
0.25 |
余甘子 |
MOL006812 |
Phyllanthin |
33.31 |
0.42 |
余甘子 |
4.2. 痛风性关节炎疾病靶点的筛选
运用DisGeNet数据库，在数据库中以“Gouty Arthritis”为关键词，查找与痛风性关节炎相关的靶点，共得到符合标准的靶点197个。将所得的药物的1304个靶点与疾病的197个靶点取交集，得到余甘子治疗痛风性关节炎的靶点39个，见图1。
Figure 1. Venn diagram of targets of intersection between Phyllanthus emblica and gouty arthritis
图1. 余甘子与痛风性关节炎交集靶点韦恩图
4.3. 蛋白质–蛋白质相互作用网络构建
为进一步分析余甘子治疗GA的关键靶点，将余甘子治疗GA的39个潜在靶点上传至STRING数据库，得到靶点之间的PPI网络，不同颜色的边代表不同类型，边的粗细代表关联分值大小，节点即为靶点，与节点相连的线越多，说明该节点在互作关系中此节点越处于核心位置，如图2所示。
4.4. 余甘子–化合物–靶点–痛风性关节炎网络图以及核心靶点的筛选
将药物余甘子、药物活性化合物、作用靶点与GA的对应关系梳理为表格，同时在Cytoscape3.9.1软件中导入数据，并绘制余甘子–化合物–靶点–痛风性关节炎网络图，见图3。根据MCC算法，结果得到11个核心靶点，颜色越深代表Degree数值越大，该靶点和GA的关联性越强，分别为TNF、MAPK14、VEGFA、IL2等11个核心靶点，见图4。
4.5. 功能富集分析
将余甘子和痛风性关节炎的交集导入DAVID数据库，分别进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，并使用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理，获得相关结果如下。
(1) KEGG通路富集分析。余甘子和痛风性关节炎交集靶点富集的通路合计71条，包括Toll-like受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路以及TNF信号通路等与GA相关的信号通路，图5主要展示P值排名靠前且与痛风性关节炎相关的信号通路。
Figure 2. Protein interaction network analysis of Phyllanthus emblica in the treatment of gout
图2. 余甘子治疗痛风的蛋白互作网络分析图
Figure 3. Network diagram of Phyllanthus emblica-compound-target-gouty arthritis
图3. 余甘子–化合物–靶点–痛风性关节炎网络图
Figure 4. Core target map
图4. 核心靶点图
Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis results
图5. KEGG通路富集分析结果
(2) GO功能富集分析。余甘子和痛风性关节炎交集靶点富集的GO功能条目共计189条，包括142条生物过程条目、23条分子功能条目和23条细胞成分条目。如图6所示，其中生物过程主要涉及VEGF激活的血管内皮生长因子受体信号通路对内皮细胞趋化性的正向调节、凋亡细胞清除的正调节、血管内皮生长因子受体-2信号通路、小胶质细胞分化、内皮屏障建立的调节、血管伤口愈合、趋化因子(C-X-C基序)配体2产生的正调节等；细胞组分主要涉及丝氨酸型内肽酶复合物、吞噬杯、蛋白质-DNA复合物、caveola、嗜天青颗粒腔、分泌颗粒腔；分组功能主要涉及鞘糖脂结合、MAP激酶活性、MAP激酶激酶活性、Hsp90蛋白结合、支架蛋白结合、内肽酶活性、蛋白酶结合等。
Figure 6. GO functional enrichment analysis
图6. GO功能富集分析
5. 讨论
本次研究的主要目的是探讨余甘子治疗痛风性关节炎的潜在机制。通过TCMSP数据库，筛选获得鞣花酸、β-谷甾醇、山奈酚、(+)-儿茶素等有效化学成分18个。鞣花酸的体内代谢物可以抑制肝细胞中的嘌呤代谢和尿酸的产生，降低血浆中的尿酸水平[14]。鞣花酸可通过减少尿酸的合成、增加尿酸排泄和调节NLRP3信号通路来改善高尿酸血症，同时还可减轻高尿酸所致的足肿胀[15]。β-谷甾醇可以通过抑制相关通路降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6等生成而起到抗炎的作用[16]。山奈酚通过下调miR-21表达，上调SOX9表达促进LPS诱导的C28/12细胞增殖，抑制细胞凋亡，减轻骨关节炎[17]。山奈酚与木犀草素能够协同抑制黄嘌呤氧化酶活性，槲皮素也能起到抑制黄嘌呤氧化酶活性，起到降尿酸的效果[18]。有研究表明，在使用秋水仙碱为阳性对照的动物实验中，木犀草素可通过下调TLR/MyD88/NF-κB通路减轻急性痛风性关节炎大鼠的炎症反应[19]。
在DisGeNeT数据库中收集了痛风性关节炎的靶点，痛风性关节炎与余甘子有共同的靶点有39个。这些靶点是余甘子治疗痛风性关节炎的潜在靶点。运用Cytoscape3.9.1软件结合MCC算法，得到了余甘子治疗痛风性关节炎的核心靶点11个，其中最重要的是TNF、MAPK14、VEGFA、IL2。抑制TNF-α、IL-6等炎症机制可以降低痛风性关节炎患者机体的损害[20]。MAPK14能够调节细胞对环境的应激反应、炎症反应等细胞重要的生理、病理过程，抑制MAPK14的表达能够降低细胞促炎因子的释放，降低炎症反应[21]。在关节炎患者中，下调VEGF的表达，减少新生血管生成，可以缓解关节炎患者的症状[22]。抑制IL2等炎症因子的水平，可以降低机体炎症反应[23]。
基于痛风性关节炎和余甘子的39个共同靶点，进行了GO分析和KEGG富集分析。GO结果表明，靶基因主要富集VEGF激活的血管内皮生长因子受体信号通路对内皮细胞趋化性的正向调节、凋亡细胞清除的正调节、血管内皮生长因子受体-2信号通路等生物学功能。KEGG富集分析结果表明，余甘子在治疗痛风性关节炎中涉及多种信号通路，主要包括Toll-like受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路以及TNF信号通路。有研究表明中药调控痛风性关节炎相关的Toll-like受体信号通路、NF-κB信号通路等信号通路可以起到抑制炎症反应以及降低血尿酸的作用，进而起到防治痛风性关节炎的作用[24]。研究表明Toll-like受体信号通路中的Toll-like受体2和Toll-like受体4参与了患者痛风性关节炎的发生和发展，尤其是在急性发作期[25]。痛风性关节炎发病的主要途径之一为Toll-like受体2/Toll-like受体4-NF-κB信号转导通路，该通路直接调控前–炎性IL-1β的表达[26]。该途径对于识别尿酸钠单钠晶体至关重要，Toll样受体特别是TLR2和TLR4可以识别这些晶体，并促进下游信号的激活，从而导致IL-1β的产生[27] [28]。这些因子进一步促进了局部的炎症反应，导致痛风性关节炎的临床表现，如红肿、疼痛和功能障碍。这些促炎症因子还可以继续激活其他免疫细胞，如中性粒细胞和单核细胞，形成一个自我维持的炎症环境，从而加剧和延长炎症反应[29]。
6. 结论
研究表明，鞣花酸、山奈酚、木犀草素、槲皮素等都有减低血尿酸水平，减轻炎症的作用。蛋白靶标TNF、MAPK14、VEGFA、IL2可能是余甘子治疗痛风性关节炎的潜在治疗靶点，Toll-like受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路以及TNF信号通路等信号通路起到治疗痛风性关节炎的作用，说明余甘子治疗痛风性关节炎是受多靶点、多通路作用的。此外本研究揭示了余甘子治疗GA的潜在分子机制，为后续基础研究提供了参考。
基金项目
云南省国际科技合作平台——滇美分子药物联合研究中心，2015IC001。
NOTES
*通讯作者。