摘要: 目的：本文报道一例罕见的重症原发免疫性血小板减少症(ITP)患者治疗过程中合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂同时依赖性假性血小板减少的病例，分析与探讨其病因，为临床工作提供处理预案及经验指导。方法：通过静脉采血同时送EDTA-K2抗凝管、肝素钠抗凝管和枸橼酸钠(1:9)抗凝管至血细胞分析仪进行PLT计数，手指末梢血采血立即手工稀释计数法作为对比。回顾性分析该例临床资料，结合文献复习探讨其发生可能的原因。结果：该例ITP患者使用EDTA-K2抗凝管、肝素钠抗凝管、枸橼酸钠(1:9)抗凝管的PLT计数分别为6.00 × 10
9/L、9.00 × 10
9/L、7.00 × 10
9/L，手指末梢血校正手工稀释计数为PLT 32.00 × 10
9/L。患者ITP出血评分5分，重症ITP合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂同时依赖性假性血小板减少诊断明确，其原因可能与自身免疫性疾病及EDTA螯合、诱导血小板活化等机制相关，临床发生率极低，很容易误诊、漏诊，影响后续治疗，需要予以关注。结论：对于重症ITP患者治疗后血小板仍低的情况，除考虑治疗效果不理想外同时需要考虑合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少的可能，需结合临床表现及时手工计数校正，可以减少临床误诊、漏诊。
Abstract: Objective: This article reports a rare case of severe primary immune thrombocytopenia (ITP) complicated with EDTA, sodium heparin, and sodium citrate anticoagulant-dependent pseudothrombocytopenia during treatment, shares and discusses its etiology, and provides treatment plans and experience guidance for clinical work. Methods: Venous blood was collected and sent to the blood cell analyzer for PLT counting in EDTA-K2 anticoagulant tubes, sodium heparin anticoagulant tubes, and sodium citrate (1:9) anticoagulant tubes. Finger-end blood sampling and immediate manual dilution counting were used as a comparison. The clinical data of this case were retrospectively analyzed, and the possible causes of its occurrence were discussed in combination with literature review. Results: The PLT counts of the ITP patient using EDTA-K2 anticoagulant tube, heparin sodium anticoagulant tube, and sodium citrate (1:9) anticoagulant tube were 6 × 109/L, 9 × 109/L, and 7 × 109/L, respectively. The PLT count of fingertip blood corrected for manual dilution was 32 × 109/L. The ITP bleeding score of the patient was 5 points, and the diagnosis of severe ITP combined with EDTA, heparin sodium, and sodium citrate anticoagulant-dependent pseudothrombocytopenia was clear. The cause may be related to autoimmune diseases and EDTA chelation, induction of platelet activation and other mechanisms. The clinical incidence is extremely low, and it is easy to misdiagnose and miss, which affects subsequent treatment and needs attention. Conclusion: For patients with severe ITP whose platelet count remains low after treatment, in addition to considering the unsatisfactory treatment effect, the possibility of EDTA, sodium heparin, and sodium citrate anticoagulant-dependent pseudothrombocytopenia should also be considered. Timely manual counting and correction should be performed based on clinical manifestations to reduce clinical misdiagnosis and missed diagnosis.
1. 引言
原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)又称免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenia, ITP)，是一种获得性自身免疫性出血性疾病，以无明确诱因的孤立性外周血血小板减少为主要特征，重症ITP的诊断标准为血小板计数 < 10 × 109/L伴有活动性出血，或出血评分 ≥ 5分[1]。以下为成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版)出血评分系统[1]，见表1。
目前国内外指南针对ITP (包括重症ITP)的一线治疗主要为糖皮质激素和静脉注射免疫球蛋白(IVIg)的应用，紧急治疗包括静脉注射免疫球蛋白(IVIg)、静脉甲泼尼龙、重组人血小板生成素(rhTPO)皮下注射、及时止血和血小板输注等，在一线正规治疗无效、口服激素无法维持及存在相关禁忌症时可考虑二、三线治疗，包括促血小板生成药(如rhTPO、海曲泊帕、艾曲泊帕等)、利妥昔单抗、免疫抑制剂、地西他滨、全反式维A酸联合达那唑、脾切除等([1], p. 3)。然而部分明确诊断ITP患者，在治疗过程中可能合并EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸盐)、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂同时依赖性假性血小板减少，相较于以往单纯EDTA依赖性假性血小板减少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia, EDTA-PTCP)更具隐蔽性，从而更容易导致误诊、漏诊，引起相应的过度诊治甚至增加血栓形成风险，需要予以重视。现报道我院一例重症原发免疫性血小板减少症(ITP)患者治疗过程中合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂同时依赖性假性血小板减少及文献复习以提高临床医生对该病的认知及诊疗水平。
Table 1. Adult ITP bleeding scoring system*
表1. 成人原发免疫性血小板减少症出血评分系统*
分值 |
年龄(岁) |
皮下出血
(於点/瘀斑/血肿) |
黏膜出血
(鼻腔/牙龈/口腔血疱/结膜) |
深部器官出血 |
≥65 |
≥75 |
头面部 |
其他部位 |
偶发、可自止 |
多发、难止 |
伴贫血 |
内脏(肺、胃肠道、
泌尿生殖系统) |
中枢神经系统 |
无贫血 |
伴贫血 |
危及生命 |
1 |
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*注释：ITP患者出血评分 = 年龄评分 + 出血评分(所有出血症状中最高的分值)。
2. 病历资料
2.1. 临床病史
患者男性，33岁，因“反复鼻衄20年余，加重12小时”于2024-08-03入院。患者20余年前无明显诱因反复出现双侧鼻衄，予以鼻腔填塞压迫后可止血，但症状反复，多次于当地医院及本院就诊，查血常规提示(初次)血小板10.00 × 109/L，外院及本院行骨髓穿刺 + 活检术，骨髓结果明确诊断为原发性免疫性血小板减少症。2011年至2023年期间多次因鼻衄住院治疗，先后使用丙种球蛋白、激素、特比澳、环磷酰胺(共8次累积量为5200 mg)、艾曲泊帕及艾曲泊帕乙醇胺片(瑞弗兰)治疗。2023年8月门诊复查血小板在正常范围内遂自行停药。12小时前患者无明显诱因再次出现双侧鼻衄，无法止血，持续出血量约500 ml，遂就诊我院急诊，行血常规提示：PLT 43.00 × 109/L，WBC 13.00 × 109/L，NEU% 91%，HGB 160 g/L。急诊拟“免疫性血小板减少性症”收住院。既往发现鼻中隔偏曲10余年。入院查体：T：36.7℃；P：109次/分；R：18次/分；BP：130/96 mmHg，神清，鼻中隔向左偏曲，双侧鼻腔粘膜出血，可见鲜红色血液持续流出，全身皮肤未见皮下出血点及紫癜。心肺腹部查体无特殊。
2.2. 实验室检查
骨髓穿刺 + 活检：(骨髓)组织造血面积约70%，三系造血细胞可见，粒系以中晚幼阶段细胞为主，可见分叶核及杆状核细胞，红系以中晚幼红细胞为主，散在或岛状分布，巨核细胞增生，12~20个/HPF，伴巨核细胞体积变小；特殊染色：网染(0)；免疫组化：E-cadherin/CD235a (红系+，分布正常)、MPO显示弥漫性分布、CD117 (肥大细胞，+)、CD34 (血管，+)、CD61 (巨核细胞，+)；病理诊断及建议：(骨髓)骨髓增生大致正常，巨核细胞增多，体积变小，结合病史，符合免疫性血小板减少症。
凝血功能、生化全套、降钙素原、病毒全套、免疫球蛋白+补体七项、大小便常规未见异常。血常规变化如下，见图1。
血常规(2024-08-03)：血红蛋白量(Hgb) 160.00g/L，血小板计数(PLT) 43.00 × 109L，白细胞计数(WBC) 13.28 × 109/L。
血常规(2024-08-04)：血红蛋白量(Hgb) 124.00 g/L，血小板计数(PLT) 17.00 × 109/L，白细胞计数(WBC) 10.31 × 109/L。
血常规(2024-08-05)：血红蛋白量(Hgb) 109.00 g/L，血小板计数(PLT) 6.00 × 109/L，白细胞计数(WBC) 20.94 × 109/L。
2024-08-05同时使用EDTA-K2抗凝管、肝素钠抗凝管、枸橼酸钠(1:9)抗凝管送检PLT计数分别为6.00 × 109/L、9.00 × 109/L、7.00 × 109/L，手指末梢血校正手工稀释计数为PLT 32.00 × 109/L。
血常规(末梢血) (2024-08-08)：血红蛋白量(Hgb) 122.00 g/L，血小板计数(PLT) 31.00 × 109/L，白细胞计数(WBC) 8.84 × 109/L。
血常规(末梢血) (2024-08-10)：血红蛋白量(Hgb) 100.00 g/L，血小板计数(PLT) 32.00 × 109/L，白细胞计数(WBC) 7.07 × 109/L。
Figure 1. Changes of platelets and hemoglobin
图1. 血小板及血红蛋白变化情况
2.3. 临床诊断
综合病史、临床表现及辅助检查明确诊断“重症ITP伴有EDTA、肝素钠、枸橼酸钠依赖性假性血小板减少”。
2.4. 诊疗经过
入院后完善相关检查，立即予以鼻内镜下明胶海绵、膨胀海绵填塞压迫止血，结合血红蛋白结果，预计失血总量达1000 ml以上，出现失血性贫血，出血评分5分，诊断重症ITP明确，余治疗上予地塞米松40 mg ivgtt qd X4d、海曲泊帕升板、止血、抑酸、抗感染等治疗。经以上治疗后患者鼻出血停止，但血小板仍进行下降，低于10.00 × 109/L，经检验科回报患者送检血液出现抗凝管血液凝集现象，遂同时使用EDTA-K2抗凝管、肝素钠抗凝管、枸橼酸钠(1:9)抗凝管送检PLT计数分别为6.00 × 109/L、9.00 × 109/L、7.00 × 109/L，手指末梢血校正手工稀释计数为PLT 32.00 × 109/L，考虑重症ITP伴有EDTA、肝素钠、枸橼酸钠依赖性假性血小板减少。经多次复查对比手指末梢血人工校正计数，患者PLT稳定在30.00 × 109/L以上，2024-08-08拔除膨胀海绵，患者无鼻出血，病情好转出院。出院后予海曲泊帕维持治疗。
3. 讨论
EDTA依赖性假性血小板减少是由于EDTA抗凝剂影响使血小板聚集导致仪器计数测定血小板数量减少的现象，在临床上称为EDTA依赖性血小板假性减少(EDTA-PTCP)，首次于1969年被Gowland等报道，临床发病率为0.09%~0.21% [2]。成人ITP的发病率为每年2~10/10万人，患病率为9~20/10万人[3]-[5]。ITP合并EDTA-PTCP在国内外仅有个案报道[6] [7]，而ITP治疗过程中同时合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少的案例在国内外极为少见，仅2014年河北保定报道了一例69岁女性在多种抗凝条件下假性血小板减少的病例[8]。
迄今为止EDTA-PTCP以及肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少发生机制尚不明确，有文献报道这种现象在重症患者中更常见，可能与自身免疫、肿瘤、动脉粥样硬化相关和肝病有关[9]。针对患者出现的这一现象，通过查阅文献资料，考虑原因可能与以下几方面相关：
(1) 自身免疫机制：EDTA-PTCP的血小板聚集相对松散，是一种不稳定的弱聚集，而抗凝剂EDTA-K2可以使存在于血小板表面的某种隐匿性抗原暴露，从而产生免疫介导的冷抗血小板自身抗体[10]。EDTA抗凝作用是通过增加血小板表面电荷来防止血小板聚集，而血小板抗体减少了血小板表面电荷[10]。EDTA-PTCP现象可以为自身免疫性疾病的一种表现形式，并且与自身免疫性疾病的疾病活动度相关，随着糖皮质激素治疗后EDTA-PTCP的现象也会随原发病好转[11]，EDTA-PTCP也可以在自身免疫性疾病缓解期出现，这可能与长期服药某些药物有关，如双氢克尿噻、甲基多巴、青霉素等[12] [13]。
(2) EDTA螯合机制：隐藏在受检者血小板表面抗原–糖蛋白GPⅡb/GPIIIa复合物内的抗原、抗体的结合位点与EDTA-K2螯合，结合位点暴露从而使其表面构象发生变化，与血浆中的抗体结合，发生抗原–抗体反应，并激活血液中内源性钙离子、5-羟色胺、花生四烯酸、凝血酶原、腺苷二磷酸磷脂酶C以及磷脂酶A等活性物质，导致纤维蛋白受体与血小板加速聚集[14] [15]。血小板表面带有负电荷的磷脂抗体也可与由EDTA-K2修饰的血小板膜表面抗原–抗体复合物发生反应，从而使血小板进一步凝集[16]。枸橼酸钠与钙离子结合成为可溶性螯合物，也可加速血小板聚集[17]。
(3) EDTA诱导血小板活化机制：EDTA可诱导血小板活化，激活血小板细胞膜中的磷脂酶A2及磷脂酶C并进一步水解释放花生四烯酸、5-羟色胺、凝血因子II以及胶原等活性物质，使血小板与凝血因子聚集[18]。
(4) 血小板卫星现象：在EDTA存在的情况下，与血小板结合的自身抗体Fc端可以与嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及红细胞膜上的Fc受体结合形成的“血小板卫星现象”[19]。
(5) 冷凝集：冷凝集发生与实验室温度依赖性相关，冷凝集素性抗体为抗红细胞抗原的IgM抗体，当温度降低达4℃时会出现红细胞凝集现象，冷凝集导致的血细胞凝集主要为红细胞，单一血小板凝集较为少见[20] [21]。
(6) 其他：在治疗ITP过程中，可能出现机体免疫机制的失衡，rh TPO联合大剂量地塞米松治疗原发ITP患者可能通过纠正T淋巴细胞亚群比例平衡紊乱从而减少ITP合并假性血小板减少症的发生[22]。另外，感染是ITP的诱发因素之一，被确定为触发因素的病毒包括巨细胞病毒、丙型肝炎、疱疹、水痘带状疱疹、EB病毒、流感和HIV，其机制是由于炎症过度激活导致外周血小板破坏增加，其中越严重的疾病病情往往越容易合并假性血小板减少[14] [23]，因此及早发现合并症、纠正电解质紊乱、使用抗生素控制感染、静脉病种球蛋白增强免疫力对患者病情发生发展也很重要。
4. 结论
对于重症ITP患者治疗后血小板不上升甚至下降的情况，除了考虑治疗效果不佳外同时需要关注是否合并EDTA、肝素钠、枸橼酸钠抗凝剂依赖性假性血小板减少的可能，需结合临床表现及时手工计数校正，可以减少临床误诊、漏诊。其发生的原因目前尚无统一定论。对于出现假性血小板减少患者的血液聚集处理应对方案，目前亦没有统一的标准，国内较为普遍的做法是：1、对于EDTA-PTCD，更换使用肝素钠抗凝管、枸橼酸钠(1:9)抗凝管分别送检，用计数值乘以1.1为最终结果，但对于同时合并EDTA、肝素钠和枸橼酸钠依赖的血小板减少病例无法使用此方法，再次之前需要排除是否与标本凝集相关，观察检测仪器的警报信息如白细胞、血小板直方图等参数[24]；2、使用末梢血涂片镜检手工计数，手工推片瑞士染色、显微镜观察血小板的形态、分布和聚集情况，或者进行末梢血的血常规分析；3、使用荧光染色激光散射法(Fluorescence Staining Laser Scattering, FSLS)或荧光血小板(Fluorescent Platelet, PLT-F)技术检测EDTA依赖性假性血小板减少症[25]，也有文献报道使用阿米卡星(或者卡那霉素)可以在EDTA依赖性假性血小板减少中有效地解聚血小板的聚集[26]-[28]。
NOTES
*通讯作者。