1. 引言
蛭类(leeches)俗称蚂蟥，隶属于环节动物门(Annelida)蛭纲(Hirudinea)，全球现已知蛭类700余种，我国蛭类资源丰富，约占世界蛭类物种数的1/6 [1]-[3]。根据栖息环境的不同，可将生活在地表有光环境中的蛭类划分为“水蛭”和“陆蛭”两大生态类群。1986年，Sawyer将所有的陆生蛭类归入山蛭科(Haemadipsidae)，包含2组17属70余种，其中3颚类组(trignathous) 5属，2颚类组(duognathous) 12属。之后，山蛭科的3颚类组被修订为2属，即三颚四环蛭属(Tritetrabdella)和山蛭属(Haemadipsa) [4]-[6]。
我们将生活在洞穴黑暗环境中的陆生蛭类特称为“洞蛭”(cave leech)。目前有关洞蛭的研究报道极为少见。我国仅见2009年由杨潼先生命名的山蛭属新种——洞穴山蛭[3]，而有关洞穴山蛭的分类地位一直以来都存在争议。随着现代分子生物学技术的发展，有学者通过系统发育分析表明，山蛭属的洞穴山蛭与三颚四环蛭属的亲缘关系较近，但在形态学数据方面，洞穴山蛭与山蛭属和三颚四环蛭属的差异都较大，因此应把洞穴山蛭从山蛭属中分离出来[7]-[9]。但由于多方面的原因，一直未见正式的分类修订。
2019年，Huang等在湘西州的多个洞穴中发现了陆生吸血性的蚂蟥，经过形态特征比较和COI基因序列比对，将其鉴定为新种，命名为武陵洞蛭，同时建立了山蛭科3颚类组的一个新属——中国洞蛭属(Sinospelaeobdella)，并将杨潼等描述的“洞穴山蛭”(Haemadipsa cavatuses)归入中国洞蛭属，将其种名修订为Sinospelaeobdella cavatuses [3]。中国洞蛭属目前仅包含洞穴山蛭和武陵洞蛭两种。前者仅分布于云南西陲德宏自治州境内的个别溶洞中[10]；后者是该属的模式种，目前已知其主要分布于湖南省湘西州境内[3]，但也在四川省邻水县[11]和贵州省务川县[12]的个别溶洞中发现了其分布。
最近，我们在广西境内的一个溶洞的洞顶壁采集到一种陆生吸血性蛭类，经形态学比较观察和COI基因序列分析，我们将其鉴定为武陵洞蛭，这是该种在广西壮族自治区境内的首次记录。该发现不仅丰富了广西蛭类多样性的内容，而且将武陵洞蛭的分布范围向南推到南纬25度附近，具有一定的洞穴生物学和动物地理学意义。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2023年11月，在广西壮族自治区桂林市临桂县会仙镇合陂村附近的燕子洞(110˚10'48″E, 25˚02'54″N，海拔195 m)的洞顶壁采集到2条陆生蛭类标本，将其带回实验室，分别编号为GXYZD2023112501和GXYZD2023112502。标本保存于吉首大学生物资源与环境科学学院动物标本室。
2.2. 方法
2.2.1. 形态观察与形态学物种鉴定
使用1 mm × 1 mm的坐标纸测量活体标本的形态学数据(体长、头宽、尾吸盘直径等指标)。再依据蛭类保存的方法[13] [14]，将活体标本置于清水中，逐渐滴加酒精直至酒精浓度达到约10%，将标本在此浓度的酒精中浸泡3~5分钟，直至标本受到刺激而不产生任何反应，再将标本转移到75%酒精中，以使其呈现自然伸展状态。最后，将标本密封保存在95%酒精中。
依据杨潼(1996)对蛭类形态的描述[1]，在体视显微镜(LEICA M205 C)下对酒精浸泡后蛭体的体色、眼点、吸盘、乳突以及两性生殖孔的位置与间隔环数等重要特征进行观测，并对其内部结构进行解剖观察。参考相关文献[1] [3] [10]-[12]进行形态特征比对和形态学物种鉴定。
2.2.2. DNA测序与数据处理
取上述1号标本的一小部分尾吸盘保存于100%酒精中，送至北京擎科生物科技股份有限公司进行mtDNA COI基因的提取、扩增和测序。其中，扩增引物选用蛭类通用引物LCO1490/HCO2198 [15] [16]，扩增反应条件设为94℃变性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃总延伸10 min，再用1%的琼脂凝胶电泳检测扩增产物，选取条带清晰明亮的产物进行纯化后测序，对测序结果进行拼接[11]。
测序结果用Chromas 2.6.5查看峰值，利用SeqMan软件进行编辑校正。然后再在NCBI上运行BLAST程序，进行比较确认，下载部分亲缘关系较近的蛭类物种序列进行序列比对，使用MEGA 11.0对序列进行校正，计算修正后的序列间的遗传距离，以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育树，进化树的各分支置信度采用1000次的自检分析进行重复检验。
最后，综合形态学特征与分子数据的比较研究，对标本进行物种鉴定。
3. 结果与分析
3.1 形态特征
广西(洞蛭)标本的体型为中等大小，大致呈长圆锥状，体前1/3段较细，呈红色或白色，体后2/3段稍显宽大，体表缺乏色素，无条纹，可较为明显地看到体内的精囊和嗉囊中储存的血餐，故活体标本的体后2/3段呈现褐色，其余部位呈微红色。乙醇浸泡后的标本呈乳白色，腹面能够很清晰地看到雌、雄生殖孔的位置，雌、雄生殖孔分别位于35/36体环和33/34体环的腹中环沟上，间隔2环。口吸盘直径较大，有颚3枚，边缘呈瓣状。共有5对眼点，第1、2对眼点呈弧形，第3、4、5对呈点状，第2对眼点最大，第5对眼点无缺失现象。身体背面各环上具有明显的乳突和背感器，但较山蛭属的小。在身体背部与尾吸盘交界处的左右两侧有3对耳状突，肛门开口于尾吸盘与第94体环之间的背部正中处，位于两侧的耳状突之间(图1)。
活体静卧时的体长为28.40/28.43 mm，比洞穴山蛭的体长要小得多，但它的吸盘吸力很强，尾吸盘上约有78条辐射肋，呈放射状，最大拉伸体长可达59.46 mm。头宽2.80/2.82 mm，整体可见27体节共94环，完全体节的环数为5环。尾吸盘较大，近圆形，其直径(5.38/5.83 mm)超过身体的最大体宽(4.60/5.00 mm) (表1)。嗉囊盲囊明显，共有14对。第1对睾丸位于阴道后，在输精管背面。
3.2. 分子鉴定
从1号标本的一小部分尾吸盘组织中有效获得了mtDNA COI基因序列685 bp，在COI序列中含有418个保守位点，221个变异位点，146个简约信息位点，75个单突变位点。经NCBI Blast检测，广西标本与武陵洞蛭的相似度最大，达到96.47%，而与洞穴山蛭的相似度仅为91.80%。基于邻接法建立的线粒体COI基因的进化树表明，广西标本与武陵洞蛭聚为一个支系，而洞穴山蛭单独形成另一个支系，均具有几乎100%的支持率(图2)。并且，广西标本与武陵洞蛭的遗传距离平均相差仅3.25%，而与洞穴山
Figure 1. External morphological characteristics of the cave leeches from Guangxi: (a) The leech inhabiting the cave ceiling; (b) The leech in repose indoor; (c) Ventral view (left) and dorsal view (right) of the specimens after soaked in ethanol; cs: caudal sucker; au: auricle; ♂: male gonopore, ♀: female gonopore; (d) Eyespots on the back of head; (e) Mastoid process and dorsal sensilla on the dorsal surface of the body; (f) Location of the au-auricle and an-anus
图1. 广西洞蛭标本的外形特征：(a) 栖息在洞顶壁的蛭体；(b) 在室内静卧时的蛭体；(c) 乙醇浸泡后标本的腹面观(左)与背面观(右)；cs：尾吸盘；au：耳状突；♂：雄性生殖孔，♀：雌性生殖孔；(d) 头部背面的眼点排列；(e) 身体背面的乳突和背感器；(f) 示耳状突和肛门所在的位置
Table 1. Comparison of morphological data of the Guangxi (cave leech) specimens with Sinospelaeobdella wulingensis and Sinospelaeobdella cavatuses
表1. 广西(洞蛭)标本与武陵洞蛭和洞穴山蛭的形态学数据比较
形态学指标 |
武陵洞蛭 Sinospelaeobdella wulingensis (Huang et al., 2019; n = 21) |
洞穴山蛭 Sinospelaeobdella cavatuses (杨潼等，2009; n = 13) |
广西标本 (n = 2) |
体长(mm) |
22.70 ± 5.02 (15.00~28.00) |
31.00~44.00 |
28.40/28.43 |
头宽(mm) |
2.30 ± 0.35 (1.80~2.80) |
2.60~3.00 |
2.80/2.82 |
最大体宽(mm) |
4.27 ± 0.72 (3.50~5.40) |
6.00~8.00 |
4.60/5.00 |
尾吸盘直径(mm) |
5.36 ± 0.73 (4.10~6.70) |
6.00~7.50 |
5.38/5.83 |
颚 |
3枚 |
3枚 |
3枚 |
完全体节环数 |
5 |
5 |
5 |
生殖孔间隔 |
2环 |
2环 |
2环 |
最大眼眼位 |
第2对 |
第1对 |
第2对 |
第5对眼 |
存在 |
很小或缺失 |
存在 |
第1对睾丸位置 |
阴道后，输精管背面 |
第14体节，输精管外部 |
阴道后，输精管背面 |
背部乳突大小 |
较小 |
较大而明显 |
较小 |
Figure 2. Phylogenetic tree constructed by NJ method based on mitochondrial COI gene
图2. 基于线粒体COI基因用NJ法构建的系统发育树
Table 2. Genetic distance between Guangxi (cave leech) specimens and species in the genus (Sinospelaeobdella) calculated based on COI gene
表2. 基于COI基因计算的广西(洞蛭)标本与属内蛭种的遗传距离
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广西标本 |
MG195986 |
MG19599 |
MG195990 |
MG195989 |
MG195987 |
MG195993 |
HQ203168 |
Sinospelaeobdella wulingensis |
广西标本 |
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MG195986 |
0.0315 |
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MG19599 |
0.0346 |
0.0157 |
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MG195990 |
0.0315 |
0.0000 |
0.0157 |
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Sinospelaeobdella cavatuses |
MG195989 |
0.0819 |
0.0961 |
0.0992 |
0.0961 |
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MG195987 |
0.0819 |
0.0961 |
0.0992 |
0.0961 |
0.0000 |
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MG195993 |
0.0835 |
0.0976 |
0.1008 |
0.0976 |
0.0142 |
0.0142 |
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HQ203168 |
0.0850 |
0.1008 |
0.1039 |
0.1008 |
0.0346 |
0.0346 |
0.0362 |
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蛭的遗传距离平均相差8.31% (表2)。综上，我们将广西的洞蛭标本鉴定为武陵洞蛭。
4. 讨论
此次采集的广西(洞蛭)标本第2对眼点最大，第5对眼点仍然存在；第1对睾丸的位置位于阴道后输精管背面，这与武陵洞蛭的相符，而与洞穴山蛭不同[2] [10]。遗传距离的分析也表明，广西标本与洞穴山蛭的亲缘关系较远(8.31%)，而与武陵洞蛭较近(约为3.25%)。之前，武陵洞蛭仅发现于湖南省湘西州[2]、四川省[11]和贵州省[12]，此次在广西境内为首次发现，因此是广西壮族自治区蛭类分布的新记录。广西在我国的动物地理区划上地处东洋界的华南区，境内喀斯特地貌复杂多样，溶洞众多，洞穴动物资源丰富，而武陵洞蛭在广西溶洞中的发现可为中国洞蛭属的起源演化研究提供基础数据，对于洞穴动物多样性的深入研究也有参考意义。
5. 小结
综合形态学与分子数据，将采自广西临桂县会仙镇燕子洞洞顶壁的陆生蛭类标本鉴定为山蛭科中国洞蛭属的武陵洞蛭(Sinospelaeobdella wulingensis)，这是武陵洞蛭在广西境内的新记录，具有一定的蛭类动物地理学意义。
致 谢
在野外标本采集和实验研究过程中，得到中国地质科学院岩溶地质研究所周黄鹤团队，以及吉首大学生物资源与环境科学学院黄兴龙博士、吴涛老师和吴清姐、张格菲、李金美等同学的支持与帮助，谨此一并致谢。
基金项目
国家自然科学基金联合基金项目(U21A2041)、国家自然科学基金资助项目(32160241)、湖南省自然科学基金项目(2021JJ30554)。
NOTES
*通讯作者。