HJAS  >> Vol. 8 No. 4 (April 2018)

    大白菜和甘蓝CBL基因的鉴定和比较分析
    Identification and Comparation Analysis of Chinese Cabbage and Cabbage CBL Genes

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作者:  

王永强,杨桂兰,杨宗辉:山东省农业科学院蔬菜花卉研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜生物学重点实验室,山东 济南;
张 卓:辽宁省锦州市太和区果树技术推广站,辽宁 锦州;
曹齐卫:东省农业科学院蔬菜花卉研究所,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东省设施蔬菜生物学重点实验室,山东 济南

关键词:
大白菜甘蓝钙调磷酸酶B亚基蛋白基因结构进化顺式元件Brassica rapa L. Brassica olerecea L. CBL Gene Structure Phylogeny Cis-Element

摘要:

植物CBL基因在逆境应答及发育过程中具有重要功能。然而,有关重要蔬菜大白菜和甘蓝CBL的研究缺乏报道。笔者在大白菜和甘蓝CBL基因组解析的基础上,对它们进行了系统比较。结果发现,大白菜和甘蓝都有16个CBL基因,它们分别位于不同的染色体上,编码区序列大小相似,在序列组成、基因结构和内含子数目上相对保守,在顺式调控元件上存在一定差异。这说明大白菜和甘蓝的CBL家族成员存在功能上的分化。本研究为进一步解析大白菜和甘蓝CBL基因在逆境应答中的功能提供了有益启示。

Plant CBL genes play important roles in stress response and development. However, knowledge about CBL genes in important vegetables Chinese cabbage and cabbage is scarce. In this text, systematic comparation was performed on the basis of genomic dissection about CBL genes of Chinese cabbage and cabbage. The results showed that there are 16 CBL genes in Chinese cabbage and cabbage genome respectively. All of them are located on different chromosomes. Their putative coding sequence size is similar, and their sequence composition, gene structure, and intron number are relatively conserved. But there is somewhat difference for their upstream ciselements, which suggests that the function of Chinese cabbage and cabbage CBL gene members are divergent. This in-vestigation will provide valuable information for further functional dissection of CBL genes of Chi-nese cabbage and cabbage in stress response.

1. 引言

作为钙感受器和钙信号系统的重要成员,植物CBL基因在生长发育和逆境应答过程中具有重要功能 [1] [2] [3] 。目前,越来越多植物物种的CBL基因被解析 [4] [5] [6] [7] ,有关CBL功能的研究也日益深入。最近研究发现,CBL家族不仅在非生物逆境应答中具有重要功能,而且在钾铁等矿质营养吸收,植物根系和种子发育以及生物逆境应答中也具有重要功能。例如,拟南芥CBL4和CBL10能够和耐盐基因SOS2编码的蛋白激酶CIPK24互作,调控地上部和根部盐胁迫应答反应 [8] [9],并且CBL10还能够直接和钾离子转运载体AKT1结合,调控植物钾离子的吸收平衡 [10] 。CBL1和CBL9不仅能够调控钾离子的吸收,而且还参与ABA信号、干旱和盐胁迫应答反应以及花粉萌发和花粉管生长 [11] [12] [13] [14] [15] ,CBL2和CBL3能够调控植物种子发育和高镁胁迫下植物的生长发育 [16] [17] ,CBL5过表达能够提高植物的抗旱性 [18] ,CBL7可以调节氮吸收 [19] 。CBL10还对盐胁迫拟南芥的生殖发育具有重要影响,拟南芥CBL10突变体的花药开裂减少,花丝变短,甚至花粉败育 [20] 。与拟南芥的CBL10直系同源的番茄CBL10基因,可以与CIPK6基因互作,调控病原物侵染后番茄细胞的程序性死亡和免疫应答反应 [21] ,水稻的某些CBL基因在水稻白叶枯抗性反应中诱导表达 [22] 。因此,植物的CBL基因具有重要的生物学功能,但是有关重要蔬菜大白菜和甘蓝中CBL的研究缺乏报道。

大白菜和甘蓝是我国主要栽培蔬菜之一,它们的抗逆性直接影响其产量和品质 [23] 。因此,系统解析甘蓝和大白菜CBL基因,对于揭示CBL在重要蔬菜中的功能以及蔬菜抗逆分子育种具有重要意义。目前,有关大白菜和甘蓝CBL基因的研究已有报道 [24] [25] ,但是有关它们的比较研究还尚未见报道。本文在深入挖掘大白菜和甘蓝CBL基因的基础上,对它们的基因结构、蛋白基序、顺式调控元件等进行了系统分析和比较研究,为下一步深入研究大白菜和甘蓝CBL基因的功能奠定基础。

2. 材料和方法

利用拟南芥的CBL基因序列在芸薹属基因组数据库中(http://brassicadb.org/brad/)搜索比对大白菜和甘蓝的基因组序列,寻找大白菜和甘蓝的CBL基因序列,并在拟南芥网站TAIR (https://www.arabidopsis.org)中进行BLAST分析,以确定大白菜和甘蓝CBL序列的真伪。对鉴定出的CBL基因进行结构分析和遗传进化分析,并对它们启动子序列中的顺式元件进行预测。结构分析利用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线进行,遗传进化分析利用MEGA4.1进行,对大白菜和甘蓝的CBL蛋白序列进行比对,采用Bootstrap Test-Neighbor Joining方法,重复500次运算;序列比对采用DNAMAN软件,顺式元件预测采用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行在线分析。亚细胞定位预测在WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)中进行。保守的蛋白基序分析利用motif Scan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在线进行。蛋白等电点分析在DNAMAN中进行。

3. 结果与分析

3.1. 大白菜和甘蓝CBL基因的鉴定和特征分析

笔者利用生物信息学的方法深入挖掘,分别从大白菜和甘蓝的基因组中鉴定出16个CBL基因。大白菜染色体A01上有6个CBL基因,A02和A09上分别有2个CBL基因,A03上有3个CBL基因,A06和A10上分别有1个CBL基因。而在甘蓝基因组中,染色体C01、C02和C07上分别有4个、3个和5个CBL基因,C03和C09上各有2个CBL基因。它们编码区大小为585 bp到822 bp不等。大白菜CBL基因除BrCBL16外显子数为7以外,其余外显子数均为8 (见表1表2图1图2)。而甘蓝CBL基因外显子情况比较复杂,其中Bol033796外显子数为5,Bol043185外显子数为10,Bol017520和Bol033796外显子数为9,Bol027877和Bol035821外显子数为7,其余基因外显子数均为8.等电点分析显示,甘蓝CBL基因编码蛋白的等电点在4.23和4.90之间,差异不大,而大白菜的CBL编码蛋白有三个等电点在5

Table 1. Molecular feature of Chinese cabbage CBL genes

表1. 大白菜CBL基因的分子特征

Table 2. Molecular feature of cabbage CBL genes

表2. 甘蓝CBL基因的分子特征

Figure 1. Exon-intron structure of Chinese cabbage CBLs

图1. 大白菜CBL基因的外显子–内含子结构

Figure 2. Exon-intron structure of cabbage CBLs

图2. 甘蓝CBL基因的外显子–内含子结构

以上(BrCBL6,BrCBL14和BrCBL16),其余都在在4.21和4.71之间。亚细胞定位预测发现,大白菜的CBL蛋白定位在细胞核和细胞质中的分别有5个,定位在叶绿体、线粒体和胞外基质的分别为2个、1个和3个;而甘蓝CBL蛋白的亚细胞定位情况与大白菜CBL蛋白定位情况一致,分别有5个定位于细胞核和细胞质中,2个定位于叶绿体中,3个位于胞外基质中,1个位于线粒体中。

3.2. 大白菜和甘蓝CBL的遗传进化和序列分析

遗传进化分析发现,大白菜的CBL基因分为五个不同的类群(见图3),类群I有五个基因:BrCBL4、BrCBL5、BrCBL6、BrCBL8和BrCBL10;类群II有两个基因,BrCBL1和BrCBL11;类群III包含三个基因:BrCBL2、BrCBL9和BrCBL14;类群IV有两个基因,BrCBL15和BrCBL16;类群V包含四个基因:BrCBL3、BrCBL7、BrCBL12和BrCBL13。

甘蓝的CBL基因划为四个不同的类群(见图4),类群I有四个基因,Bol018933、Bol09687、Bol020153及Bol037119;类群II包含三个基因Bol035821、Bol016477和Bol022447;类群III有五个基因,Bol039648、Bol039649、Bol042297、Bol018174和Bol027877;类群IV包含四个基因,Bol017520、Bol013539、Bol033796和Bol043185。从进化分析来看,大白菜和甘蓝的基因组中存在多个CBL姊妹对基因,这可能是基因复制的结果。

从大白菜和甘蓝CBL蛋白序基序来看(见表3表4),这些蛋白都含有3个EF手结构域。此外,除Bol043185外,其余CBL都有1~3个糖基化位点;除BrCBL4、7、12和Bol039648、Bol018174、Bol017520和Bol03379外,都含有1~3个豆蔻酰化位点;除Bol013539、Bol039648和Bol027877外,其余CBL都含有1~3个磷酸激酶c磷酸化位点。从大白菜和甘蓝CBL蛋白序列比对分析结果来看,它们存在一些十分保守的氨基酸位点,如100%保守的氨基酸位点有多个f位点,还有K、g、i、e、p、ke、fd和fhp,相对保守的与CIPK互作的FPSF位点等。这些保守的氨基酸位点可能对CBL功能的发挥具有重要影响。

Figure 3. Phylogeny of Chinese cabbage CBLs

图3. 大白菜CBL基因的遗传进化

Figure 4. Phylogeny of cabbage CBLs

图4. 甘蓝CBL基因的遗传进化

Table 3. Motifs of Chinese cabbage CBL proteins

表3. 大白菜CBL基序分析

Table 4. Motifs of cabbage CBL proteins

表4. 甘蓝CBL蛋白基序分析

3.3. 大白菜和甘蓝CBL基因的顺式调控元件和功能预测

顺式调控元件分析预测可为基因功能的研究提供线索。笔者研究发现,在大白菜和甘蓝的CBL基因上游序列中(启始密码子ATG上游1500 bp)存在多个应答不同激素和逆境的顺式元件,且不同成员拥有的顺式元件的种类和数目各不相同(见表5表6)。根据遗传进化和顺式元件分析的结果,推测BrCBL1在盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫、脱落酸、乙烯、赤霉素、水杨酸等多种激素应答过程中具有一定功能,BrCBL2在脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯、赤霉素以及干旱胁迫、钾铁离子吸收、花粉管萌发伸长等方面具有一定功能,BrCBL3在盐胁迫、热、干旱胁迫及茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素等应答中具有一定功能,BrCBL4在盐、干旱胁迫以及茉莉酸甲酯应答方面发挥作用,BrCBL5在茉莉酸甲酯、赤霉素、生长素应答及干旱、温度胁迫应答中具有一定作用,BrCBL6在茉莉酸甲酯、赤霉素、ABA应答和干旱胁迫、镁离子胁迫、种子发育及花粉管伸长和光反应中具有一定功能,BrCBL7可响应盐胁迫、干旱、低温胁迫及赤霉素、水杨酸信号,BrCBL8可应答茉莉酸甲酯、赤霉素和水杨酸信号,在低温、干旱逆境响应及植物发育过程中具有一定功能,BrCBL9在乙烯和赤霉素信号响应及盐胁迫、干旱、低温胁迫和缺钾应答中具有一定功能,BrCBL10参与植株生长发育、ABA、茉莉酸甲酯、赤霉素信号应答和镁离子胁迫、钾离子吸收、干旱和防卫反应,BrCBL11参与盐、干旱、热胁迫应答以及茉莉酸甲酯、水杨酸等激素信号响应,BrCBL12可响应茉莉酸甲酯、生长素和水杨酸信号,以及热和干旱等逆境胁迫,BrCBL13可响应脱落酸等多种激素信号,在干旱、温度胁迫及钾等养分吸收过程中具有一定功能,BrCBL14可应答脱落酸、赤霉素等多种激素信号以及钾、铁的转运吸收,BrCBL15和BrCBL16在干旱胁迫及热胁迫应答中具有一定功能。根据甘蓝CBL顺式元件分析结果以及与拟南芥CBL基因的遗传进化关系(见图5),推测甘蓝的各个CBL成员也具有与拟南芥的直系同源CBL基因相似的功能。总之,它们在多种激素应答和逆境应答中发挥各不相同的功能。

Table 5. Cis-elements of Chinese cabbage CBLs

表5. 大白菜CBL顺式元件分析

注:ABRE为脱落酸应答元件,CGTCA-motif为茉莉酸甲酯(MeJA)应答元件,ERE为乙烯应答元件,GARE-motif和P-ox为赤霉素应答元件,HSE为热胁迫应答元件,LTR为低温应答元件,MBS为干旱应答元件,TC-rich repeats为逆境和防卫应答元件,TGA-element位生长素应答元件,TCA-element为水杨酸应答元件,W box为病原物答元件。

Table 6. Cis-elements of cabbage CBLs

表6. 甘蓝CBL顺式元件

Figure 5. Phylogeny of Chinese cabbage and cabbage CBLs

图5. 大白菜和甘蓝CBL的遗传进化

4. 结论

笔者从大白菜和甘蓝的基因组中分别鉴定出16个CBL基因,它们分别位于大白菜和甘蓝不同的染色体上。这些基因在结构和序列上相对保守,但也存在一定的差异,而且它们在顺式元件组成上差异较大。因此,笔者认为大白菜和甘蓝的CBL基因存在功能上的分化。分析还发现,在大白菜和甘蓝CBL基因的上游序列中,都存在多个应答不同逆境和激素的顺式元件,由此推测它们具有多样的生物学功能,不仅参与非生物逆境如温度胁迫、盐胁迫应答等过程,还参与生物逆境应答过程。本文为进一步研究大白菜和甘蓝CBL基因的功能奠定了基础。

基金项目

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011SW042),国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-23-G14)。

NOTES

*通讯作者。

文章引用:
李利斌, 张卓, 王永强, 杨桂兰, 杨宗辉, 孟昭娟, 曹齐卫. 大白菜和甘蓝CBL基因的鉴定和比较分析[J]. 农业科学, 2018, 8(4): 349-359. https://doi.org/10.12677/HJAS.2018.84056

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