评估菇类菌丝复合性饮品之大鼠致畸试验

Prenatal Developmental Toxicity Study for a Mushroom Mycelia Complex Drink in Rats

摘要: 本試验依据卫生福利部公告之健康食品安全性评估方法，对大鼠胚胎发育之影响及造成畸胎的可能性；测试之菇类菌丝复合性饮品，是以樟芝菌丝体发酵全液为主体，添加各1% (v/v)的巴西蘑菇菌丝体浓缩发酵滤液、云芝菌丝体浓缩发酵滤液、舞茸子实体浓缩萃取液及桑黄子实体浓缩萃取液，经调整糖酸比后制成。共设置4组试验组，为对照组、低、中及高剂量组，投予剂量分别为180、360及720 mL/kg Body Weight (B.W.)，分别为人体每日建议口服剂量(人体每日360 mL/60kg B.W.)之30倍、60倍及120倍。每组各使用20只完成配种的雌性Sprague-Dawley (SD)品系母鼠，以口服管喂方式分别于怀孕第6至15天投予试验物质，并于怀孕第20天将各组怀孕母鼠安乐死后以帝王切开术进行解剖检查。试验结果显示，各剂量组与对照组比较，母鼠子宫重量、胚胎着床数、胚胎着床前损失率、胚胎着床后损失率及胎数体重在统计上均无明显差异(p > 0.05)；胎鼠之外观、内脏及骨骼检查，各剂量组及对照组胎鼠均未显示明显之畸胎现象。综合以上实验结果，菇类菌丝复合性饮品于本试验设计条件下，对大鼠胚胎发育不会造成不良影响；其投予剂量最高可达720 mL/kg B.W.，为人体建议摄取量(每日360 mL/60kg B.W.)之120倍。

Abstract: This study was conducted to assess the prenatal developmental toxicity of a mushroom mycelia complex drink according to the safety assessment guideline of Health Food announced by Ministry of Health and welfare, Executive Yuan of Taiwan. Concentrated aqueous extract (1% v/v) from Grifola frondosa fruit body, Agaricus blazai mycelia, Phellinus linteus fruit body and Coriolus versicolor mycelia was added to the mycelium fermentation broth of Antrodia cinnamomea to produce a mushroom mycelia complex drink after the adjustment of the sweet and sour ratio. A total of 4 test groups were established in this present study: a negative control group, a low dose group, a medium dose group, and a high dose group. Rats in the low, medium and high dose groups were administered the test article at doses of 180 mL/kg B.W., 360 mL/kg B.W., and 720 mL/kg B.W., respectively and the doses mentioned above were the 30×, 60× and 120× compared with the recommended daily intake og 360 mg/60kg B.W. A total of 20 successfully conceiving female Sprague-Dawley (SD) rats were used for each group. The test article was administered orally to female rats between days 6 and 15 of their pregnancy. On the 20th day og pregnancy, the rats were euthanized, caesarean sections were performed, and macroscopic examinations were conducted. Results indicated that weight of uterus, fetal body weight, number of corpora lutea, implantation sites, pre-implantation loss, post-implantation loss of the test groups and negative control group exhibited no statistical differences. According to the results of the fetal external, organ and skeletal examination, no fetal deformations were caused by the test article. Therefore, the results of the present study indicated that administering the maximum dosage of the mushroom mycelia complex drink (The dose of 720 mg/kg/day was the 120× compared with recommended daily intake of 360 mg/60kg B.W.) results in no deformations or negative influences on rat fetal development.

1. 引言

菇类为一种高等真菌，目前全球所发现之菇类约有14,000种，其中可食用者为2000种以上，但被人工驯化栽培成功的仅约100种左右，具有经济价值者约为40多种，约20多种可实际商业化栽培者则 [1] 。人类使用或食用的历史非常悠久，在二千多年前的《礼记》中即有对菇类的介绍，为中国最早食用菇相关的记载；此外，《神农本草经》亦有记载 [2] ，因而可以知道菇类在中国的传统药草中占有一席之地，灵芝(Ganoderma lucidum)、冬虫夏草(Hirsutella sinensis)、茯苓(Wolfiporia cocos)等已被使用数百年以上，而有些具有生理活性的新兴食药用菇菌，则在近数十年间才逐渐被研究与开发，如巴西蘑菇(Agaricus blazei Murill) [3] 、舞菇(Grifola frondosa) [4] 、云芝(Trametes versicolor, Coriolus versicolor或Polyporus versicolor) [5] 、桑黄(Phellinus linteus) [6] 和樟芝(Antrodia cinnamomea, Syn. Antrodia camphorata and Taiwan of ungus camphorata) [7] 等便是其中几种特殊且具机能性的菇类，其代谢产物成分对于健康具有调节及促进作用，因此被制成补疗药品或保健食品，如饮品、胶囊、浓缩液、调味料、茶和美容护肤产品等。多数的人认为改变饮食可以增进健康，这意味着保健食品的未来市场极为广大；但是食品最重要的就是讲求其安全性，大多数菇类虽具有长期食用历史，但在改变制程、剂型、加工制造时，少有针对菇类或复合性食品进行安全性的评估。到目前为止，巴西蘑菇子实体 [8] 、桑黄子实体水萃物 [9] 、云芝菌丝体 [10] [11] 和舞菇菌丝体 [12] [13] 在Ames试验、体外和体内染色体畸变试验及28天亚急毒性试验项目，于文献报导皆未观察到任何毒性症状，但也未找到相关致畸胎试验研究；樟芝菌丝体除了三项基因毒 [14] 和28天亚急毒性试验 [15] 之外，在90天亚慢毒性试验 [16] 及二期生殖与发育毒性试验 [17] [18] 中，结果均未观察到任何毒性症状。在2011年陈等人 [17] 就以樟芝液态发酵菌丝体冻干粉末进行大鼠致畸胎的评估，试验结果均无观察到任何生殖与发育毒性症状，但所使用的最高剂量为500 mg/kg/day，仅只达人体建议摄取剂量之20倍，且未对胎鼠的内脏及骨骼做深入的探讨；2014年李等人 [18] 进行评估的樟芝液态发酵菌丝体冻干粉致畸性试验，其最小无毒性剂量no-observed-adverse-effect level (NOAEL)达3500 mg/kg/day，在母鼠与胎鼠检查皆未发现明显的二期生殖与发育毒性，仅只在食物消耗量方面较对照组下降，但非为试验物质造成之影响；在2015年林等人 [19] 及2017年林佑鑫 [20] 分别进行了固态培养牛樟芝菌丝体的安全性评估，其中在致畸胎研究部分，剂量分别为700~2800及500~2500 mg/kg/day，也没有观察到相关的发育毒性(致畸胎性)反应。目前研究中并无发现巴西蘑菇、桑黄、云芝、舞菇等新兴和具功效性菇类对孕妇食用安全，也就是致畸胎的测试，也没有观察到复合菇类的安全性评估试验，故针对菇类菌丝体复合性饮品进行致畸胎性试验评估有其重要性，除了在追求食用功效之外，对于食用安全不会再有疑虑，为安全性评价提供依据，作为产品开发及人体食用之剂量考虑；本研究评估之菇类菌丝体复合性饮品，为结合具有保护肝脏 [3] [21] [22] [23] 、抑制发炎 [24] [25] 及改善肝脏功能 [4] [26] [27] 的菇类真菌发酵萃取物，是以樟芝液态发酵菌丝体调合巴西蘑菇菌丝体、云芝菌丝体、桑黄子实体萃取液和舞菇子实体萃取液制成，并依照卫生福利部公告的「健康食品安全性评估方法」 [28] [29] ，测试对大鼠胚胎发育之影响及造成畸胎的可能性，为其安全性评价提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 供试菌种、液态发酵菌丝体发酵条件

2.1.1. 供试菌种

樟芝菌丝体(Bioresource Collection and Research Center (BCRC) 35398)、云芝菌丝体(BCRC 36450)和巴西蘑菇菌丝体(BCRC 36814)购自台湾新竹市食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心。舞茸子实体购自台湾屏东县台湾北斗生技股份有限公司，桑黄子实体购自台湾桃园市源铭企业有限公司。

2.1.2. 菌丝体液体发酵条件及子实体萃取条件

樟芝菌丝体、云芝菌丝体和巴西蘑菇菌丝体为分别在发酵槽中进行液态发酵的培养，其无菌接种及发酵槽操作的参数相似。在无菌操作台中，将potato dextrose agar (PDA)平板上长好的菌丝体，取0.5 cm大小正方的菌块，接种入内含1 L液体培养基的2 L三角瓶中，于25℃、100 rpm中震荡培养七天，后接种入内含400 L液体培养液的500公升级发酵槽，在0.5 vvm的通气量和温度25℃中培养七天，再接种入内含有40吨液体培养液的50吨级发酵槽，在50 rpm的搅拌，0.5 vvm的通气量和25℃的温度中培养十四天后，得菌丝体发酵液；樟芝菌丝体发酵全液直接作为菇类菌丝复合饮品主体；云芝和巴西蘑菇菌丝体发酵液个别进行离心及上清液浓缩，可得到云芝和巴西蘑菇菌丝体浓缩发酵滤液。舞茸及桑黄子实体经清洗及解碎后，以100℃水萃取30分钟，滤渣后浓缩，即为舞茸及桑黄子实体浓缩萃取液。

2.2. 试验物质

以樟芝菌丝体发酵全液为主体，添加各1% (v/v)姬松茸菌丝体浓缩发酵滤液、云芝菌丝体浓缩发酵滤液、舞茸子实体浓缩萃取液及桑黄子实体浓缩萃取液，经调整糖酸比后制成的菇类菌丝复合性饮品(以下简称菇类复合饮，Antrodia aqua)。

2.3. 试验动物

Sprague-Dawley (SD)品系怀孕母鼠 (乐斯科生物科技股份有限公司，台湾)，饲养环境为22℃ ± 3℃、相对湿度55% ± 15%、换气频率10~15次/小时、照明12小时的动物房。采个别笼饲，动物经约3天适应后，期间每日进行临床症状之观察，经兽医确认状况良好，才用于进行试验。饲料为进口饲料(MFG，Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japan)，垫料为Lognocel FS-14 (J. Rettenmaier & SöhneGmbH + Co.KG., Germany)，饮水以水瓶方式供应经高温高压灭菌之逆渗透水。所有动物实验根据国际药物及化学物质独行试验规范及卫生署健康食品安全性评估方法进行，大鼠为适用于致畸胎试验之实验动物，经实验动物照護及使用委员会审查同意，核准编号(IACUC No. 104-9b)。

2.4. 试验设计

在试验物质投予第一天，依据体重进行排序及随机分成四组，每组动物20只。分别为对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组。低、中及高剂量组大鼠试验物质投予剂量分别为180 mL/kg B.W.、360 mL/kg B.W.及720 mL/kg B.W.，分别为人体每日建议口服剂量(人体每日360 mL/kg B.W.)之30倍、60倍及120倍。详细分组如表1所显示。

试验期间，每天秤取适量之试验物质，加入逆渗透水至所需体积搅拌均匀后配置成浓度分别为0.073 g/mL、0.145 g/mL及0.291 g/mL之悬浮液。配置完成之试验物质容液限当天使用。口服为人体使用方式，本试验选择以管喂方式作为投予途径，以塑料针筒套上喂食针(16 gauge，80 mm长)之方式进行管喂。各剂量组及对照组大鼠每日管喂试验物质或对照物质，单次投予体积10 mL/kg B.W.，总体积过大才多次喂食，总投予体积为30 mL/kg B.W.，6小時內完成投予。

试验期间每日进行怀孕母鼠之临床观察及结算各组饲料摄取量，于怀孕的第6~20天每日对各组大鼠进行秤重。于母鼠怀孕第20天，以吸入二氧化碳方式将所有母鼠进行安乐死，剖腹取出子宫及胎鼠。秤取胎鼠的重量，并记录着床数、活胎数、死胎数、再吸收胎数(resorption number)及计算母鼠两侧卵巢之

Table 1. Four dose groups for reproductive and developmental toxicity tests

表1.进行生殖与发育毒性试验的四个剂量组别

黄体数目。逐一检查所有胎鼠，外观是否显现任何异常，并根据其外生殖器辨别性别，计算雄性及雌性胎鼠的比率。每胎约一半的胎鼠经10%中性福尔马林溶液固定后，依据Leroy M. and Jocteur-Monrozier A. (2013) [30] 及Critcheell K. (2013) [31] 的方法检查胎鼠头部、颈部、胸腔及腹腔中器官之构造；每胎约一半的胎鼠经Alizarin red S染色处理后，依据Manson and Kang (1994) [32] 及Christian (2007) [33] 骨骼异常评估方法，观察其骨骼内部型态之变化。

2.5. 数据整理与分析

实验数据以平均值(mean)及标准偏差(standard deviation, S.D.)表示，母鼠之体重、摄食量、子宫重量、胎鼠重量、黄体数量、着床数量及着床前后损失率，均利用SPSS统计软件中单因子变异数分析(One-Way ANOVA)及Duncan’s multiple range test分析各组间差异性，并以p值小于0.05作为显着差异水平；此外，胎鼠性别比例、胎鼠外观检查、内脏检查及骨骼检查结果，则利用SPSS统计软件中的卡方测定(Chi-squared test)进行统计分析各组间之差异性，并以p值小于0.05作为显着差异水平。

3. 結果

3.1. 菇类复合饮对母鼠的影响

试验期间，各组母鼠经投予对照组质或试验物质后均无显现任何异常临床症状，所有动物均存活致试验结束，且肉眼病变检查均无显现任何异常。如图1所示，各剂量组母鼠怀孕第6~20天之体重与对照组相比较无统计上差异(p > 0.05)，显示投予菇类复合饮对怀孕母鼠之增重无不良之影响。平均摄食量如图2所示，母鼠怀孕之摄食量在高剂量组第8、9与17天，中剂量组第6、8、9、11、12、14与16天，低剂量组第6、8、14、18与19天，与对照组相比较出现统计上差异(p < 0.05)，但无剂量相关性，应与试验物质无关。

怀孕母鼠生殖毒性参数评估数据呈现于表2。对照组及3组剂量组成功怀孕的母鼠分别为20只、20只、20只及20只。胎鼠平均体重在中(4.2 ± 0.8)、高(4.1 ± 0.4)剂量组与对照组(3.9 ± 0.8)相比较具显著增加(p < 0.05)，但均于正常参考范围内 (胎数体重：3.03~5.78 g)；胎鼠性别比例在低剂量组(1.07)统计上明显高于对照组(0.68) (p < 0.05)，但仍在正常參考範圍內(性別比例：0.59~1.53)。其余生殖毒性参数包括胎鼠总数、带胎子宫重量、黄体数、活胎或死胎数、再吸收数、着床前损失、着床后损失等参数，组间并

Figure 1. The average body weight changes of the pregnant rats during the test period

图1. 怀孕母鼠平均体重

^*与对造组比较具显着性差异(p < 0.05)。

Figure 2. The average feed intake of the pregment rats during the test period

图2. 怀孕母鼠平均摄食量

Table 2. The assessment of reproductive toxicity parameters in pregnant rats

表2.怀孕母鼠生殖毒性参数评估

^a所有数据均以Mean ± S.D.表示。^b胎鼠性别比例 = 雄性胎鼠数÷雌性胎鼠数。^c着床前损失率 (%) = [(黄体数 − 着床数)/黄体数] × 100%。^d着床后损失率 (%) = [(着床数 − 存活胎鼠数)/着床数] × 100%。^*与对造组比较具显着性差异 (p < 0.05)。

无统计上的差异(p > 0.05)，显示菇类复合饮对胎鼠存活情形无不良影响。

3.2. 菇类复合饮对胎鼠的影响

胎鼠之外观及内脏检查结果如表3所示。外观检查结果显示各剂量组均无发现外观异常之胎鼠。内脏检查结果显示，各组均发现输尿管扩张及出现肾盂扩张情形之胎鼠，但组间并无统计上之差异(p > 0.05)，因此推测并非试验物质所引发的变异。

胎鼠骨骼检查结果如表4所示，胎鼠骨骼变异主要为胸骨(sternebrae)未钙化、脊椎(vertebrae)椎体双

Table 3. Results of fetal external and organ examination

表3. 胎鼠外观及内脏检查结果

Table 4. Results of fetal skeletal examination

表4. 胎鼠骨骼检查结果

^*与对照组比较具显着差异性(p < 0.05)。

(a) 正常胎鼠胸骨；(b) 胎鼠胸骨第6胸骨未钙化(↑处)；(c) 胎鼠第5胸骨未钙化(↑处)；(d) 正常胎鼠指骨；(e) 胎鼠第5掌骨未钙化(↑处)；(f) 分岔之脊椎(↑处)。

Figure 3. Result of fetal skeletal examination

图3. 胎鼠骨骼检查结果

叉、掌骨(metacarpal)未钙化等(图3)。试验结果显示，在各胎鼠第2或第5掌骨未钙化之总数及比率，高剂量组在统计上显著低于对照组(p < 0.05)，对照组及3组剂量组分别为6/124 (4.8%)、2/125 (1.6%)、4/124 (3.2%)及1/130 (0.8%)，但在窝数与比率上各组间无统计上之差异(p > 0.05)，由于统计上下降之结果并非不良之反应，于此推测并非试验物质所引发的变异。其余胸椎椎体(centrum of vertebrae)双叉及第5、第6胸骨未钙化等结果，各组间均无统计上之差异(p > 0.05)，因此推测并非试验物质所引发的变异。

4. 讨论

根据研究统计指出，每年全球约有6%的婴儿(约800万)出生时带有严重的缺陷 [34] ，其中的25%为先天或部分遗传性的严重缺陷，10%为母体暴露于一些环境因素而导致孩童出生时带有缺陷，然而，大多数的重大出生缺陷，约65%，其病因不明 [35] 。因此，为保障孕妇服用菇类复合饮之安全性以及胎儿的健康，致畸胎试验的评估相当重要。本次试验结果显示，各剂量组与对照组相比较，母鼠子宫重量、胚胎着床数、胚胎着床前损失率、胚胎着床后损失率及胎鼠体重在统计上均无明显差异(p > 0.05)。胎鼠之外观，内脏及骨骼检查结果显示，各剂量组及对照组胎鼠均未显示明显致畸胎现象。综合以上试验结果，以樟芝液态发酵菌丝体调合巴西蘑菇菌丝体、云芝菌丝体、桑黄子实体萃取液和舞菇子实体萃取液制成的菇类菌丝体复合性饮品，于此试验条件设计下，对大鼠胚胎发育不会造成不良影响。其投予剂量最高达720 mL/kg B.W.，此剂量为人体建议摄取量(每日360 mL/60 kg B.W.)之120倍。

NOTES

^*通讯作者。