材料科学  >> Vol. 8 No. 5 (May 2018)

脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料中生长因子的定量检测
Quantitative Detection of Growth Factors in Porcine Small Intestinal Submucosa Matrix Materials

DOI: 10.12677/MS.2018.85070, PDF, HTML, XML, 下载: 679  浏览: 1,038  科研立项经费支持

作者: 张 扬, 夏磊磊, 门福民, 郑晓龙, 张晋辉, 陈 毅*, 赵 博:北京博辉瑞进生物科技有限公司,北京;高建萍:中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京

关键词: 猪小肠粘膜下层脱细胞基质转化生长因子碱性成纤维细胞生长因子血管内皮生长因子Porcine Small Intestinal Submucosa Acellular Matrix Transforming Growth Factor Basic Fibroblast Growth Factor Vascular Endothelial Growth Factor

摘要: 采取液氮冷冻粉碎技术将猪小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS, Small Intestinal Submucosa)粉碎,再通过预处理将SIS材料中的三种活性生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、转化生长因子(TGFβ1)和血管内皮生长因子(VEGF)释放出来,以便采用特异性酶联免疫(ELISA)试剂盒检测,进而得到样品中三种活性生长因子的含量。两种不同的SIS产品(VIDASISTM和Biodesign®)中的检测结果表明:VIDASISTM中TGFβ1的的含量为8375 ± 2125 pg/g、VEGF的含量为5486 ± 1043 pg/g、FGF2的含量为3990 ± 1372 pg/g;Biodesign®中TGFβ1的的含量为11517 ± 331 pg/g、VEGF的含量为5432 ± 272 pg/g、FGF2的含量为5417 ± 947 pg/g。
Abstract: In this study, three growth factors including basic fibroblast growth factor (FGF2), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in two SIS products (VIDASISTM and Biodesign®) were quantified by enzyme linked immune sorbent assay (ELISA) kit through the preliminary treatment of liquid nitrogen freezing and grinding technology which was aimed to release the growth factors from the tissue. Results showed that contents of TGFβ1, VEGF and FGF2 in VIDASISTM were 8375 ± 2125 pg/g, 5486 ± 1043 pg/g and 3990 ± 1372 pg/g respec-tively; while the corresponding contents in Biodesign® were 11517 ± 1331 pg/g, 5432 ± 272 pg/g and 5417 ± 947 pg/g.

文章引用: 张扬, 夏磊磊, 高建萍, 门福民, 郑晓龙, 张晋辉, 陈毅, 赵博. 脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料中生长因子的定量检测[J]. 材料科学, 2018, 8(5): 595-602. https://doi.org/10.12677/MS.2018.85070

1. 引言

猪小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS, Small Intestinal Submucosa)是猪小肠粘膜下层通过脱细胞、成型和灭菌等工艺制备而成的膜状材料,具有生物相容性高、生物可降解和可吸收等优点,广泛用于肌腱、硬脑膜、腹壁和皮肤等组织的修复或重建 [1] [2] 。传统修补术手术时间较长、张力大等缺点影响患者的恢复,SIS材料可在一定程度上改善这些缺陷,其诱导细胞黏附生长、感染率低等特点可证实SIS是一种良好的动物源植入材料。SIS补片的成分主要包括I、III型胶原、纤维连接蛋白和多种生长因子(TGF-β、VEGF和FGF等) [2] [3] 。生长因子是由多种细胞分泌,作用于特定的靶细胞,调节细胞分裂、基质合成与组织分化的细胞因子,有助于细胞功能的增强和血管化的形成 [4] [5] 。在体内组织中,细胞、生长因子及ECM共处于一个动态环境之中,三者之间的多重相互作用构成了体内细胞生存的微环境 [6] 。它们是高活性、多功能的多肽或蛋白质,主要在近距离发挥局部作用,它们与受体的亲和力极高,也极容易受外界影响而失活。创面愈合是一个复杂的生物学过程,生长因子在改善各种生理和病理状态、促进组织再生、修复及创伤愈合过程等方面日益发挥着重要的作用,其关键在于在促进肉芽组织形成的同时,加速创面再上皮化进程 [7] 。

TGF-β是一种丰富的骨基质蛋白,也是一种肽类抗炎症生长因子,广泛存在于正常组织及转化细胞中,在血小板和骨组织中含量较高,在骨形成和骨重建过程中发挥着极其重要的作用,可以通过控制免疫细胞(T细胞、B细胞等)的增殖、分化和活化来进行免疫调节,促进伤口愈合以及血管发生等 [8] [9] [10] 。VEGF是对血管内皮细胞具有高度特异性的血管源性生长因子,由血小板、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成骨细胞或肿瘤细胞等合成和分泌,对于新血管形成至关重要,具有增加血管通透性和促进内皮细胞增殖等功能,还具有保护神经的作用,其中对VEGF的研究最多也最深入 [8] [11] 。FGF是一组具有相似结构特征的多肽,广泛存在于机体组织内,目前已知FGF家族至少包括23个可编码相关结构蛋白的基因。FGF具有很强的促细胞分裂和增殖活性的作用,可诱导毛细血管的生成。在FGF2提取中使用到肝素,肝素与FGF2结合形成稳定的复合物,可以保持此类生长因子的生物活性,肝素也可以直接结合到FGF2受体上 [6] [8] [12] 。

ELISA试剂盒多用于检测血清或血浆中的生长因子,而组织中的生长因子不易提取和检测,本实验采用三种方法对样品进行预处理,进而释放出SIS中的活性生长因子,再通过ELISA试剂盒检测生长因子的含量,通过对比筛选出SIS中不同生长因子适宜的前处理方法,并与进口同类产品中生长因子的含量进行了比较。

2. 实验部分

2.1. 主要材料

SIS (VIDASISTM)由北京博辉瑞进生物科技有限公司提供;SIS (Biodesign®)购自美国库克公司;ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司;尿素购自西陇化工股份有限公司;肝素钠购自国药集团化学试剂有限公司;I型胶原酶购自北京欣经科生物技术有限公司。

2.2. 主要仪器

冷冻粉碎机(LT-100),中科耐驰(北京)技术有限公司;LGJ-100F真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司;HC-2518R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;Thermo全波扫描多功能酶标仪VARIOSKAN FLASH,美国Thermo Fisher公司。

2.3. 主要试剂的配制

1) Buffer 1:2.5 mg/mL肝素钠;2 mol/L尿素。

2) Buffer 2:50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4;0.36 mmol/L CaCl2

2.4. 实验方法

2.4.1. 冷冻粉碎步骤

将干燥SIS补片材料用无菌手术剪刀剪成尺寸小于1 × 1 cm2的小片,便于SIS材料进入粉碎机内部;将粗碎的SIS材料放在进料台上,使用不锈钢进料棒将SIS材料送进冷冻粉碎机进料口,并向进料口处持续注入适量液氮,在进料口处混合SIS与液氮,利用粉碎机粉腔体内部的负压,使SIS粉料与液氮吸入粉碎腔,粉碎温度−196℃;粉碎腔出口处设有不锈钢筛网,孔径80~100目,利用出口处的正压,将符合尺寸的SIS粉送出粉碎腔,出口处用透气性好的无菌布袋收集粉碎好的SIS粉料;在停止供液氮后需迅速将SIS粉料放入无菌密封罐或自封袋中备用,待恢复室温后方可打开取用。

2.4.2. 活性生长因子提取方法

通过以下三种方法分别提取三种活性生长因子:

方法一:称取SIS材料粉碎后样品5 mg,加入1 mL Buffer 1,高速低温匀浆20~30 min至液体呈胶体状,14000 rpm高速离心30 min,提取上清液,定容到1 mL,4℃保存。

方法二:称取SIS材料粉碎后样品5 mg,加入1 mL Buffer 1,高速低温匀浆20~30 min至液体呈胶体状,于4℃匀速搅拌24 h,14000 rpm高速离心30 min,提取上清液,定容到1 mL,4℃保存。

方法三:称取SIS材料粉碎后样品50 mg,加入8 mL Buffer 2,100℃变性10 min,冷却后加入200 μg胶原酶I,于37℃酶解1 h,离心取上清;沉淀加入8 mL Buffer 2和200 μg胶原酶I,于37℃酶解1 h,离心取上清;反复至第五次提取上清;将上清液合并冻干收集并称重。称取5 mg冻干物加入1 mL Buffer 1,4℃保存。

方法一和方法二通过不同的处理方法尽可能多地释放生长因子,方法三则通过酶解的方式去除胶原蛋白等高丰度物质,进而提取生长因子。三种方法经高速离心之后上清液中主要含有生长因子及其他微量蛋白,由于ELISA试剂盒是基于抗原抗体特异性结合的检测方法,故上清液中其他物质对检测几乎无影响。

2.4.3. ELISA检测方法

TGFβ1和VEGF采用双抗夹心ELISA法,FGF2采用竞争抑制ELISA法。

将三种方法处理的样品按ELISA试剂盒说明书操作,操作步骤如下(以TGFβ1为例):

1) 加样:分别设置标准孔、待测样品孔、空白孔,依次加入100 μL不同浓度的标准品和样品,空白孔加标准品缓冲液,酶标板覆膜后37℃温育1 h,弃去液体后甩干;

2) 每孔加检测溶液A工作液100 μL,37℃温育1 h,弃去液体,每孔用350 μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干,该过程重复3次;

3) 每孔加检测溶液B工作液100 μL,37℃温育1 h,弃去液体,每孔用350 μL洗涤液洗涤1~2 min并甩干,该过程重复5次;

4) 每孔加90 μL TMB底物溶液,37℃避光显色(10~20 min),每孔加50 μL 终止溶液终止反应,轻轻摇匀;

5) 立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值(O.D.值);

6) 根据标准品建立标准曲线,代入公式得到样品中活性生长因子含量,再换算成其在SIS补片样品干重中的含量。

3. 结果与讨论

3.1. 检测结果

3.1.1. TGFβ1检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的TGFβ1标准品在450 nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图1所示。

图2所示,通过方法一检测VIDASISTM中TGFβ1的含量为5391 ± 370 pg/g,Biodesign®中TGFβ1的含量为6702 ± 230 pg/g;方法二检测VIDASISTM中TGFβ1的含量为8375 ± 2125 pg/g,Biodesign®中TGFβ1的含量为11517 ± 331 pg/g;方法三检测两种SIS补片中TGFβ1的含量基本为零。

3.1.2. VEGF检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的VEGF标准品在450 nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图3所示。

图4所示,通过方法一检测VIDASISTM中VEGF的含量为3974 ± 871 pg/g,Biodesign®中VEGF的含量为5213 ± 737 pg/g;方法二检测VIDASISTM中VEGF的含量为5486 ± 1043 pg/g,Biodesign®中VEGF的含量为5432 ± 272 pg/g;方法三检测两种SIS补片中VEGF的含量基本为零。

3.1.3. FGF2检测结果

根据ELISA试剂盒不同浓度的FGF2标准品在450 nm波长下的光密度值(O.D.值)做成标准曲线,如图5所示。

图6所示,通过方法一检测VIDASISTM中FGF2的含量为3990 ± 1372 pg/g,Biodesign® 中FGF2

Figure 1. The correlation curve between the concentration of TGFβ1 standard and O.D. value

图1. 不同浓度TGFβ1标准品的O.D.值标准曲线

Figure 2. Comparison of TGFβ1 assay results of different sample preparation methods

图2. 不同样品前处理方法的TGFβ1检测结果对比

Figure 3. The correlation between the concentration of VEGF standard and O.D. value

图3. 不同浓度VEGF标准品的O.D.值标准曲线

Figure 4. Comparison of VEGF assay results of different sample preparation methods

图4. 不同样品前处理方法VEGF检测结果对比

Figure 5. The correlation between the concentration of FGF2 standard and O.D. value

图5. 不同浓度FGF2标准品的O.D.值标准曲线

Figure 6. Comparison of FGF2 assay results of different sample preparation methods

图6. 不同样品前处理方法FGF2检测结果对比

的含量为5417 ± 947 pg/g;方法二检测VIDASISTM中FGF2的含量为2668 ± 384 pg/g,Biodesign®中FGF2的含量为2887 ± 154 pg/g;方法三检测两种SIS补片中FGF2的含量基本为零。

3.2. 讨论

本研究对猪小肠粘膜下层脱细胞基质中的三种生长因子(TGFβ1、VEGF、FGF2)进行检测,由于生长因子对温度非常敏感,样品前处理过程均处于低温条件下。Buffer 1中加入肝素钠,可使生长因子和肝素结合从而保持并促进其活性,肝素是糖胺聚糖(GAG)的一种,糖胺聚糖也是脱细胞基质(ECM)的重要组成部分,许多活性生长因子通过肝素HS分子紧密结合到特定的ECM中 [6] ,其中FGF2与肝素结合是研究最透彻的。

参考文献 [13] 和文献 [14] 中活性生长因子的提取方法时,由于两种SIS产品VIDASISTM和Biodesign®在生产过程中有除去蛋白酶(胰酶等)的工艺,故Buffer 1中加入肝素和尿素即可,不必加入各种蛋白酶抑制剂的混合物。方法一采用ELISA试剂盒说明书中样品预处理步骤,SIS被高速匀浆成胶体状态,生长因子释放出来并与肝素结合保持活性;方法二中SIS被匀浆成胶体状再低温搅拌24 h,使生长因子充分释放出来;方法三先用胶原酶将SIS中的胶原蛋白酶解,使低丰度蛋白(纤维连接蛋白和生长因子等)释放出来,但检测过程中发现几乎检测不到生长因子,可能是处理过程中100℃的高温会导致生长因子变性,失去活性的生长因子不能与试剂盒中的固相载体结合。TGFβ1和VEGF用方法二检测含量最高,但FGF2用方法一检测含量最高,因为肝素与FGF2结合不但可以保持其活性,还会抑制此类活性生长因子的释放 [6] 。组织中生长因子释放难、检测方法单一的问题需要进一步探究,从而建立新的更为简便、准确的检测方法。

4. 结论

生长因子对提取条件要求非常严格,不同的生长因子由于其种类和作用机制的不同,其适宜的提取方法也不尽相同。该实验通过对SIS材料生长因子的预处理方法的比较,得到三种生长因子(TGFβ1、VEGF、FGF2)最适宜的提取方法并检测其含量。其中VIDASISTM中TGFβ1的的含量为8375 ± 2125 pg/g、VEGF的含量为5486 ± 1043 pg/g、FGF2的含量为3990 ± 1372 pg/g;Biodesign®中TGFβ1的含量为11517 ± 331 pg/g、VEGF的含量为5432 ± 272 pg/g、FGF2的含量为5417 ± 947 pg/g。

基金项目

本研究得到国家863计划新材料领域专项(2015AA033602),北京市科技新星计划(Z181100006218013)和科技部中小企业创新基金(Z14010101281)的经费支持。

参考文献

NOTES

*通讯作者。

参考文献

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