摘要:
本实验以蜂蜜、老陈醋和黑豆作为原材料，研发的一种具有三者功能整合的新即食食品，并检测相关项目，为蜜醋黑豆生产质量标准的制定提供重要依据。用感官评定，设计出符合要求的产品，再用超高效液相色谱(UPLC)测定蜜醋黑豆各生产关键环节的染料木苷含量，调整工艺，并检测其他相关指标。最终产品豆粒饱满，呈红黑色，软硬适中，酸甜适宜，染料木苷含量为139.080 mg/kg，平均回收率为97.6%，RSD = 0.98% (n = 5)，产品的水分含量为40.1 g/100g，灰分含量为4.57 g/100g，水溶性浸出物含量为14.57 g/100g，总酸含量为16.5 g/kg。用UPLC测定蜜醋黑豆中的染料木苷含量的方法，结果可靠方便，蜜醋黑豆产品研发完成，各项数据良好。
Abstract:
In this experiment, honey, vinegar and black beans as raw materials, research and development of a new integration of the three functions of instant food, and detection of related projects, provide an important basis for the formulation of the quality standards of production. We used sensory evaluation to design products that meet the requirements, than Ultra high performance liquid chromatography (UPLC) was used to determine the content of genistein in the key components of honey-and-vinegar-black-beans, to adjust the technology, and to detect other related indexes. The final product has full grain and it is red or black, soft and moderate, sweet and sour suitable, genistin content is 139.080 mg/kg, the average recovery was 97.6% and the RSD was 0.98% (n = 5). At the same time, the experiment also found that the moisture content of the product was 40.1 g/100g, the ash content was 4.57 g/100g, the content of water-soluble extract was 14.57 g/100g, and the total acid content was 16.5 g/kg. Honey-and-vinegar-black-beans product development completed, the testing data of product is very good, and the method for determining the content of genistein by UPLC is reliable and convenient.
1. 引言
黑豆(Glycine max)，又名乌豆、黑豆、冬豆子，为豆科植物大豆的黑色种子，主要产于中国、日本、韩国、美国等地区 [1] 。黑豆中含异黄酮类——大豆黄酮苷和染料木苷；皂苷——大豆皂醇A、B、C、D、E五个苷元。黑大豆所含皂甙有抑制脂肪酸吸收，促进其分解的作用及预防肥胖的功效。黑豆中的多糖成分还可以促进骨髓组织的生长，刺激造血功能的再生。黑豆味甘性平，具有祛风除热、调中下气、解毒利尿、补肾养血之功能。既能补身，又能去疾，药食咸宜 [2] - [7] 。目前醋泡黑豆工艺均用高温炒熟，这样操作有受热不均、不能连续进行、温度不好控制、易炸裂和易糊豆等缺点 [8] 。本实验利用恒温烘熟工艺熟化黑豆，灭活抗营养因子，可以最大程度保留黑豆的有效成分。而浸泡陈醋后加入蜂蜜，旨在利用其优良的风味对黑豆抑苦去涩 [9] [10] 。同时能促进人体吸收和新陈代谢，还能让黑豆中的营养元素溶出，并使花青素等抗氧化性成分更好地发挥作用 [11] 。蜂蜜还有恢复精力、消除身体积食、促进消化，缩短排便时间和放松神经等功效 [12] 。
本实验研究的“蜜醋黑豆”是整合了黑豆、蜂蜜和老陈醋三者食疗功效的即食食品，具有美容、减肥、补肾、明目、乌发的功能，有改善便秘、高血压、高血脂、腰酸腿痛、糖尿病、前列腺病、白发、冠心病等功效 [13] [14] 。为确保生产质量，奠定其工厂化生产基础，计划对蜜醋黑豆进行感官评定和理化性质检测，并在关键生产环节中跟踪大豆异黄酮的主要成分——染料木苷的动态变化情况，为建立蜜醋黑豆质量标准提供实验依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
青仁乌豆(百粮创信)，产自内蒙古辽通市开鲁县，优质新鲜，形态完整；益母草蜂蜜(光临)，呈黄色黏液状，无沉淀；6˚山西老陈醋(宁化府)，呈黑色液体状，无沉淀；染料木苷(Genistin)标准品(批号: 26210050)，上海安谱实验科技股份有限公司，白色粉末状，4℃密封保存；甲醇试剂(批号：20151203043)，山东禹王实业有限公司化工分公司，色谱纯；冰醋酸试剂(批号：20150101)，广东光华科技股份有限公司，分析纯等。
超高效液相色谱仪(美国UPLC H-CLASS)、旋转蒸发器(上海亚荣RE-52AA)、台式高速离心机(艾迪TGL16M)、立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江LS-150LD)、电热鼓风干燥箱(上海博讯GZX-9240MBE)、电子天平(感量0.01 mg、感量0.01 g)等。
2.2. 实验方法
2.2.1. 原料预处理
选取外形呈椭圆形、大小均匀、饱满有光泽的青仁黑豆，称重(每批次4000克)，清洗干净。将黑豆放入电热鼓风干燥箱中进行灭酶熟化温度为80℃。为了防止黑豆因受热过猛而炸裂，烘箱温度是从常温逐渐升温到目标温度。约4个小时后，黑豆烘干且熟化后即可取出，自然降温。黑豆烘熟称重后，首次加入老陈醋时，黑豆：老陈醋 = 1:1，再加入新鲜生姜片，浸泡时间为12小时。第二天需再次加醋，量为第一次的50%，浸泡时间为36小时。浸泡完毕后得到中间产品称为“醋黑豆”，此时老陈醋与生姜产生的独特风味成为了蜜醋黑豆的主要底味。醋黑豆十分坚硬，需软化处理，121℃高温高压后，再密封保存于钢盆中，自然冷却。常温下，拌入白砂糖，4小时后加入蜂蜜，静置4个小时。
2.2.2. 感官评定
参考GB 2712-2014 食品安全国家标准 豆制品 [15] 制订以下的标准评分表(见表1)，邀请10位志愿者，品尝后分别进行打分。
Table 1. Sensory evaluation of the Honey-and-vinegar-black-beans
表1. 蜜醋黑豆的感官评分表
2.2.3. 优化配方
本实验采用四因素三水平的L9 (34)正交实验，以总感官得分作为指标，筛选出最佳的蜜醋黑豆配方。(注：表2中的添加量是以黑豆重量为基数的百分比。)
Table 2. Orthogonal factor level of Honey-and-vinegar-black-beans
表2. 蜜醋黑豆配方的正交因素水平
2.2.4. 理化指标测定
水分含量对于产品的保质期有一定的影响力，需要测定水分含量，并将每批产品的水分含量都限制在一定的范围内，才能确保产品货架期，并保证产品质量。故选用烘干法 [16] ，测定10批供试品的水分。按照食品中灰分的测定方法 [17] ，测定5批供试品。选用热浸法 [18] ，测定5批供试品的水溶性浸出物。选用PH电位法 [19] ，测定5批供试品的总酸含量。
2.2.5. 染料木苷含量测定
1) 试样制备。检测四大关键生产环节中的产物，测定5批供试品。①分别取有代表性的未加工黑豆及熟化后的黑豆样品500 g，用粉碎机粉碎后通过60目样品筛，混匀后装入洁净容器作为试样，密封备用。②醋黑豆、软化后的醋黑豆以及蜜醋黑豆的处理：分别取有代表性的样品500 g，用组织捣碎机捣碎，混匀后装入洁净容器作为试样，密封备用 [20] 。
2) 对照品溶液制备。精密称取染料木苷标准品1 mg溶于100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度线，超声波30℃助溶5 min，制成10 mg/L的染料木苷标准母液。再精密吸取10 mg/L染料木苷标准母液2.5 mL于100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度线，配成250 μg/L染料木苷标准液 [22] 。
3) 样品溶液的制备。称取2.5 g试样于250 mL具塞三角瓶中，加入45 mL 90%甲醇溶液，置于超声波清洗器中60℃提取30 min，在离心机中，用10,000 r/min的速度离心10 min。然后取上清液，转移至100 mL浓缩瓶中，在旋转蒸发器中，设置60℃，浓缩至约20 mL。浓缩液转入50 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液冲洗浓缩瓶并定容至刻度。取1 mL提取液，在100 mL容量瓶中稀释100倍(由于原材料中染料木苷含量较高，需适当稀释)。取1 mL稀释后的提取液，通过0.45 μm滤膜后，保存待用。每份样品需分别制备3份平行样品溶液，供超高效液相色谱仪测定 [20] [21] 。
4) 色谱条件。在雷红伟 [22] 等人研究方法的基础上进行改进，本研究采用超高效液相色谱对染料木苷进行检测，条件如下：CORTECS C18 Column (4.6 mm × 100 mm, 2.7 μm)色谱柱(爱尔兰)；流动相为甲醇：冰醋酸：水 = 45:1:55；流速为0.5 mL/min；柱温25℃；样品温度15℃；检测波长259 nm。
5) 线性关系考察。分别吸取8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 mL 250 μg/L染料木苷标准液于10 mL容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度线，依次得浓度为200.00、100.00、50.00、25.00、12.50 μg/L的标准液，分别以10 μL进样，测定峰面积。以对照品溶液进样量X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线，染料木苷标准品在0.1250~2.0000 ng范围内与峰面积呈线性关系，得到回归方程。
6) 精密度考察。取100 μg/L对照品溶液5份，分别以10 μL进样，计算出峰面积积分值RSD。
7) 重复性考察。取5份供试品溶液，分别以10 μL进样。
8) 加标回收率实验。取已知含量为69.5 μg/L的供试品5份，每份3 ml，分别加入50 μg/L的对照品溶液1 ml，通过0.45 μm滤膜，进样测定。
3. 结果与分析
3.1. 最佳配方的确定
Table 3. Orthogonal test results of honey-and-vinegar-black-beans
表3. 蜜醋黑豆配方正交试验结果
由表3可知，在实验设计范围内，四种因素中白砂糖添加量对蜜醋黑豆的感官影响最大，生姜添加量对产品的影响相对较小。经计算，蜜醋黑豆的感官最优的工艺条件为A1B2C2D2，即：生姜添加量为2%，软化处理时间为10分钟，白砂糖添加量为10%，蜂蜜添加量为8%。
3.2. 理化指标测定结果
Figure 1. Water content determination results
图1. 水分含量测定结果
Figure 2. Determination of ash content
图2. 灰分含量测定结果
Figure 3. Results of determination of water soluble extract content
图3. 水溶性浸出物含量测定结果
Figure 4. Total acid content determination results
图4. 总酸含量测定结果
水分含量测定结果(见图1)平均值为40.1 g/100g, SD = 0.84。灰分含量测定结果(见图2)平均值为4.57 g/100g, SD = 0.29。水溶性浸出物含量测定结果(见图3)平均值为14.57 g/100g, SD = 0.25。总酸含量测定结果(见图4)平均值为16.5 g/kg, SD = 0.58。综上所述，产品质量稳定，各项指标均保持在稳定水平，每个批次都没有明显差异，酸度和水分均利于保存，是适口的酸性食品。
Figure 6. UPLC detection spectrum of genistein standard liquid
图6. 染料木苷标准液的超高效液相检测图谱
Figure 8. Results of repeatability survey
图8. 重复性实验结果
3.3. 染料木苷检测方法确定
Table 4. Experimental investigation results of sample addition recovery
表4. 加样回收率实验考察结果
本实验利用超高效液相色谱(UPLC)测定染料木苷的含量，具有快捷简便、灵敏度更高、进样量更少等特点。染料木苷标准品在0.1250~2.0000 ng范围内与峰面积形成良好的线性关系，R2 = 0.9996 (见图5)，标品图谱见图6。精密度实验RSD = 0.19% (见图7)；重复性考察RSD = 0.98% (见图8)；加标回收率实验考察的平均回收率为97.6%, RSD = 0.47% (见表4)。上述实验数据表明，该实验方法可靠，实验方案可行，可以用来测定蜜醋黑豆中染料木苷的含量。
3.4. 染料木苷含量的测定结果
Table 5. The results of genistein measure
表5. 染料木苷最终测定结果
Figure 9. UPLC detection spectrum of Honey-and-vinegar-black-beans
图9. 蜜醋黑豆样品的超高效液相检测图谱
4. 讨论
本实验以大豆异黄酮成分中的染料木苷为对照品，探索出用UPLC检测染料木苷的色谱条件和前处理方法，样品检测结果图谱见图9，而后动态跟踪蜜醋黑豆生产各环节产品中染料木苷的含量变化，从而观察功效成分的减少程度并验证蜜醋黑豆生产工艺的可靠性，确定其各生产环节中进行质量控制的节点。在此基础上，对蜜醋黑豆质量控制标准进行研究。
本实验工艺创新点：利用热风烘干进行醋泡黑豆的熟化处理；利用高温高压将豆类食品软化后密封冷却使其重新拥有嚼劲。最终，制得的蜜醋黑豆产品，老陈醋和蜂蜜味极其浓郁，原料来源安全，具有一定的保健功能，营养价值丰富，有较高的市场推广应用价值。根据各项检测数据可为生产质量标准制定提供参考(见表6和表7)：
Table 8. Significance analysis of final determination results of genistein
表8. 染料木苷最终测定结果显著性分析
利用表5检测结果进行分析可得出表8，可以看出A与其余样品均有显著性差异，B、C、D之间无显著性差异，而D与E也无显著性差异。由此可知整个加工过程中，染料木苷的含量都是在逐步降低的，从而推断出大豆异黄酮的含量也在逐步降低。对染料木苷含量影响最大的工艺是恒温烘熟处理(即步骤A，需放置烘箱4小时)，由此可见，后续应该对熟化时间进行调整，以期在保证产品质量的情况下，保留更多的有效成分。
目前，检测即食食品中大豆异黄酮含量的方法极少，本实验能提供了相关的实验依据，供大家参考。长期服用蜜醋黑豆还有提高免疫力、使皮肤光滑和提亮肤色等一系列效果，目前大豆异黄酮的作用机理及最佳服用量还未明确。值得进一步研究。
NOTES
*通讯作者。