OJNS  >> Vol. 7 No. 1 (January 2019)

    野生红托竹荪菌株分离驯化与区别性鉴定
    Isolation, Domestication and Differential Identification of Wild Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou

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作者:  

孙 燕,李 浪,刘 妮,潘高潮,刘虹虹:贵州省山地资源研究所,贵州 贵阳;
邹方伦,龙汉武:贵州省生物研究所,贵州 贵阳;
乔东生:大方县东生昂立食用菌基地,贵州 毕节

关键词:
野生红托竹荪分离驯化不同栽培种区别性鉴定Wild Dictyophora rubrovalvata Zang ji et liou Isolation and Domestication Different Cultivars Differential Identification

摘要:

采集异地野生红托竹荪8 ~ 9成熟菌蛋子实体,分离驯化母种、栽培种,察看农艺性状,对栽培种作区别性鉴定实验。结果:驯化培育栽培种菌丝洁白、浓密,长势旺盛;对峙培养栽培种,20天左右,不同栽培种菌落菌丝相遇互不相让,形成一道加深隔离线,产生拮抗反应。相同栽培种菌落菌丝融合在一起,没有发生拮抗反应。结论:拮抗实验操作简单,用时短,可以区分红托竹荪不同菌种。

In this paper, the eggs of 8 - 9 mature Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou were collected, the mother species were isolated and domesticated, cultivated species were cultivated, agronomic characters were observed, and the differentiation of cultivated species was carried out. Results: The mycelium of cultivated species was white, dense and vigorous, and about 20 days after cultivation, the colony mycelium of different cultivated species met with each other, forming a deep isolation line and antagonistic reaction. The mycelium of the same cultivated species was fused together and there was no antagonistic reaction. Conclusion: The antagonistic experiment is simple in operation and short in time, and it can be used to distinguish different strains of Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou.

1. 引言

红托竹荪(Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou),担子菌门,鬼笔科(Phallaceae)竹荪属(Dictyophora)大型食用菌。我国竹荪食用历史悠久,早在唐代段成式的《酉阳杂俎》一书中已有记载。野生竹荪多生长在有大量竹子残体和腐殖质的竹林地里,味道鲜美可口,素有“菌中皇后”、“山珍之王”的称号,且价格昂贵 [1] [2] [3] [4] [5] 。现作为商业性生产的红托竹荪,主要分布在贵州、福建、四川、云南等地。由于得天独厚的气候条件,贵州已成为红托竹荪主产地。伴随着竹荪产业的快速发展,菌种使用量急剧增加,菌种使用过程中,由于管理意识不强,菌种存在混乱现象,造成优劣菌株菌种难以区分,给引种、栽培、开发利用带来很多困难。

本实验采集异地野生红托竹荪8~9成熟菌蛋子实体,分离驯化制作母种、栽培种,同时对菌种进行拮抗实验。拮抗反应是国家农业部NY/T 1845-2010 [6] [7] 标准中规定的食用菌菌种区别性鉴定方法,常用于担子菌的菌种鉴别研究,红托竹荪属担子菌门,利用拮抗反应对其菌种区别性鉴定目前还未见报道。鉴定包括母种、原种和栽培种,生产中栽培种用量较多,本实验对栽培种进行区别性鉴定。

2. 材料与实验步骤

2.1. 仪器设备、试剂

电子分析天平(感量0.01 g),高压灭菌锅,超净工作台,人工气候箱,培养皿,烧杯,玻璃棒,漏斗,煮锅,电磁炉,量筒,花钵,温湿度计,土壤湿度计,接种工具;马铃薯,葡萄糖(分析纯),琼脂,水,阔叶杂木屑,麸皮,过磷酸钙,白糖,拌料盆等。

2.2. 试验步骤

2.2.1. 培养基制备

1、试管、平板PDA培养基制备

挑选品相好马铃薯,剜去芽眼部位,削皮切薄片,称取400克置煮锅中,加水2000 ml,加热煮沸约15分钟,搅动薯片均匀受热至酥而不烂。4层洁净纱布过滤至2000 ml烧杯中,加水补足2000 ml。滤液倒入煮锅,加40 g葡萄糖,搅拌使其充分溶解,缓慢加入40 g琼脂粉,快速搅拌,让琼脂完全溶解,培养基形成。培养基分成两部分,一部分趁热分装入试管,分装量约为试管长度的四分之一,管口不沾染培养基,稍冷却,塞上硅胶塞,形成试管培养基;另一部分趁热装入三角瓶中,装入量约为瓶容量三分之一左右,透气盖密封瓶口,将包装好平面皿、装好培养基的试管和三角瓶于高压锅中灭菌30分钟,灭菌后试管培养基趁热摆成斜面,三角瓶中培养基趁热倒入培养皿中,盖好,待培养基冷却,试管及平板培养基制备完成。

2、栽培种培养基制作

1) 原料质量配比及具体要求:阔叶杂木屑78%,麸皮20%,过磷酸钙1%,白糖1%。原料要求无霉变,含水量 < 12%,粉碎颗粒 > 5 mm,过磷酸钙含有效P2O5 14%~20%,白糖市售食用等级。

2) 培养基制作:称取阔叶杂木屑于干净料盆中,加入水使其全部淹没原料,浸泡过夜,滤去水分,按配比加入麸皮、过磷酸钙、白糖,搅拌均匀,检查调整培养基含水量55%~60%,形成培养基。

3) 装瓶、装袋:将培养基装入菌种袋或瓶,压紧培养基,用清水洗净菌袋或瓶口内外空置部分,套上菌袋盖或瓶塞。

4) 灭菌:将装好培养基的菌袋和菌种瓶置灭菌锅中,121℃灭菌保持1小时,温度降至60℃~70℃,取出菌种袋和菌种瓶,放入超净工作台内,自然冷却,菌种瓶和菌种袋培养基形成。

2.2.2. 菌种分离、转接

1、菌种分离

1) 采集8~9成熟新鲜竹荪蛋子实体,用无菌脱脂棉擦去表面土及其他杂物,装入自封袋,放低温采样箱内保存,及时带回实验室,采集记录见表1图1

2) 超净工作台内无菌条件下,用解剖刀挑取小块白色组织(菌柄、菌裙)接入试管培养基中部,与培养基充分接触,见图2

3) 分离菌种后,试管放入人工气候箱25℃恒温培养,观察萌发状况,有污染,及时检出。菌丝长满管后,选菌落均匀、菌丝健壮的菌种扩管形成母种,见图2

2、菌种转接

在超净工作台无菌条件下,接种针挑取小块母种转接入菌种瓶和菌种袋中,置于人工气候箱25℃恒温培养,观察菌丝生长情况,无污染菌丝生长浓密、健壮,长满菌种瓶,形成栽培种,见图3

2.2.3. 区别性鉴定实验

原理:两个不同菌株对峙培养时发生拮抗反应,是某些真菌识别异己,保持群体遗传多样性的反映。它是由基因组内异核体不亲和(hetero-karyon incompatibility, het)位点控制的。当不亲和的菌株共同培养时,由于het位点的识别作用,菌株间就会产生拮抗反应,在交界处形成隆起、沟或隔离,从而防止遗传上明显不同的个体间菌丝的融合,以保持个体遗传上的独立和稳定 [7] 。红托竹荪两菌株区别性鉴定实验操作如下:

1) 接种组合和重复

接种组合为3组。第一组:S1菌种与S2菌种,各接种1个接种块;第二组:S1菌种与S1菌种,各接种1个接种块;第三组:S2菌种与S2菌种,各接种1个接种块。每组3个重复。分别进行对峙培养。

2) 接种操作

在超净工作台内严格按无菌接种操作,分别取菌种作接种块,两接种块间隔30 mm以上,菌丝朝上,放在培养皿内(如图4图5图6)。

3) 培养条件

红托竹荪属中低温品种,在5℃~28℃均能生长,以18℃~22℃最为适宜,调节气候箱,给予其适宜温度25℃,湿度自然,通风、避光培养20 d~30 d。

4) 拮抗反应的观察和判断

在灯下或自然光下,观察培养皿表面红托竹荪两菌株菌落交界处是否呈现隆起型、沟型、隔离型反应。培养物表面菌丝有隆起型、沟型、隔离型三者之一为有拮抗反应,两个菌种块为不同菌种,培养物表面菌丝未呈现隆起型、沟型、隔离型三者之一的为无拮抗反应。

3. 结果讨论

3.1. 结果

Table 1. Collection and recording of bacteria eggs of Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou

表1. 红托竹荪菌蛋采集记录

S1 S2

Figure 1. Wild situation of S1/S2 bacteria strain

图1. S1、S2两菌株野生境地

Figure 2. Production of mother species

图2. 母种制作

Figure 3. Production of cultivated species

图3. 栽培种制作

S1 S2

Figure 4. Antagonistic experiment of two different strains of S1 and S2

图4. S1、S2两个不同菌种拮抗实验

Figure 5. S1/S1 two identical strains

图5. S1、S1两个相同菌种

Figure 6. S2/S2 two identical strains

图6. S2、S2两个相同菌种

Table 2. Antagonistic reaction between species of Dictyophora rubrovalvata Zang, ji et liou

表2. 红托竹荪菌种间拮抗反应

注:“+”表明菌株之间有拮抗反应,“−”表明菌株间没有拮抗反应。

表1图1为项目组人员分别于2018年5月和8月调查当地农户,踩点采集到的野生红托竹荪生境,与文献报道相符合,生长在竹林地里。图2为超净工作台内子实体组织分离接种在试管培养基后,放置在25℃恒温培养箱内,竹荪生长50天后菌丝长满管。图3为栽培料灭菌后接入母种25℃,培养90天菌丝长满瓶,菌丝洁白,浓密,长势良好。图4图5图6为栽培种接种到平板培养基,培养箱25℃对峙培养20天产生的性状,图4不同栽培种发生拮抗反应,两不通栽培种菌丝形成一道隔离线,互不相让。图5图6为两个相同栽培种培养后菌丝融合在一起,没有发生拮抗现象。

3.2. 讨论

采自贵州贵定、大方的野生红托竹荪经组织分离驯化母种(图2)、栽培种(图3),农艺性状表现:菌丝洁白,浓密,生长旺盛,性状良好。食用菌栽培成功与否,高产优质的栽培菌种是关键之一。竹荪母种、栽培种在转管继代培养多代之后,菌株优良性状退化,因此不断采集野生菌株子实体,通过分离菌种、驯化、栽培试验,选育优良菌株及区别性鉴定生产菌种,是竹荪生产的重要环节 [8] 。判别野生菌株是否为适合人工栽培的优良菌株,需要对菌株分离驯化,并进行栽培小试,中试,根据出菇情况、菌株生长条件、农艺性状及产量,确定是否为优良菌种。本文所采两株野生竹荪,在分离驯化成栽培种后,还需要做出菇试验,才能确定是否为优良菌株菌种。

母种分离可通过孢子、子实体和菌丝体三个途径获得。孢子萌发率低,萌发慢,菌丝长满琼脂斜面需90~100天;菌丝体染杂率高,分离技术要求严格,需50~60天长满琼脂斜面;子实体的组织分离培养,菌丝萌发快,技术较易掌握,需40~50天长满琼脂斜面 [9] 。子实体分离接种部位包括菌柄、菌裙、中包被、基质层、产孢体、内包被、原基层,生产中菌种分离部位多采用菌柄、菌裙。

区别性鉴定拮抗实验见图4图5图6表2,红托竹荪菌丝在培养皿内生长,不同时期菌丝形态略有差异。5天左右开始萌发,初期菌丝洁白,短而融,10 d~30 d菌丝变长,颜色洁白,浓密,粗壮。温度超过28℃,菌丝出现变红和倒伏症状。25℃条件,20天左右,不同菌种菌落相遇互不相让,形成一道明显的白色隔离带,两菌落都不能越过隔离带继续生长,表现出拮抗反应,说明亲缘关系较远。30天左右气生菌丝布满培养皿,隔离带颜色加深,拮抗更为明显。同一菌种间两菌落菌丝表面平整,无色素沉积或菌丝隆起等现象,菌丝融合在一起生长,无拮抗现象存在。说明红托竹荪拮抗实验对红托竹荪不同菌种进行区分鉴定是可行的,由于操作方便、成本低,且鉴定结果易于观察,在生产上适合推广使用。

基金项目

贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2016]2600);贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2017]2510-1);贵州省基金项目:黔科合基础[2018]1147。

文章引用:
孙燕, 李浪, 刘妮, 潘高潮, 刘虹虹, 邹方伦, 龙汉武, 乔东生. 野生红托竹荪菌株分离驯化与区别性鉴定[J]. 自然科学, 2019, 7(1): 18-23. https://doi.org/10.12677/OJNS.2019.71003

参考文献

[1] 朱利泉, 邓艳霞. 竹荪的研究与利用[J]. 中国野生植物资源杂志, 2000(3): 21-23.
[2] 潘高潮, 龙汉武, 吴迪, 等. 贵州省红托竹荪菌蛋烂皮病的发生与防治[J]. 中国食用菌, 2015, 34(5): 72-75.
[3] 邹方伦, 宋培浪, 等. 中国•贵州高等真菌原色图鉴[M]. 贵阳: 贵州科技出版社, 2009.
[4] 邹方伦, 宋培浪, 等. 贵州特色菌物和珍稀菌类的栽培与驯化研究[M]. 贵阳: 贵州科技出版社, 2007.
[5] 吴迪, 邓琴, 秦樊鑫, 等. 黔产红托竹荪基地土壤中重金属含量及其生态危害风险评价[J]. 土壤通报, 2013, 44(3): 719-722.
[6] 姚方杰, 于娅, 方明, 等. 黑木耳菌种区别性鉴定的对峙培养法及其应用[J]. 食药用菌, 2017, 25(3): 163-165.
[7] 农业部. 食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应[S]. 中华人民共和国农业行业标准, NT/T 1845-2010, 北京: 中国农业出版社.
[8] 沈伯葵, 郁世军. 竹荪菌种分离培养的研究[J]. 林业科技开发, 1993(1): 37-38.
[9] 陈仲春, 雷华忠, 杨仲材. 竹荪驯化及栽培试验[J]. 农业科技通讯, 1980(8): 24-25.