1. 引言
臭鳜鱼为新鲜鳜鱼腌制发酵后的产物，因其生“臭”熟香 [1] 、味道鲜美、风味独特 [2]，成为徽菜的代表之一。影响臭鳜鱼风味的物质较多，脂肪族醛类是较为重要的一大类 [3]，研究表明，脂质降解和氧化会产生脂肪族醛类 [4]。一般而言，影响脂类物质水解的酶主要有脂肪酶和磷脂酶 [5]。
本文以臭鳜鱼为研究对象，对加工过程中不同部位肌肉的酸脂酶、中性脂肪酶和磷脂酶活性的变化情况进行研究，以期为臭鳜鱼的深入研究提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验试剂
Na2HPO4、柠檬酸、氢氯酸、C4H11NO3、Na2-EDTA、Triton X-100、NaF、95%乙醇、CuSO4、酒石酸钾钠，均为分析纯。
2.1.2. 仪器设备
匀浆机，722紫外分光光度计，电子天平，恒温数显水浴锅，荧光分光光度计，pH计，控温磁力搅拌器，冷冻离心机。
2.2. 实验方法
工艺流程
原料处理、腌制→研碎→匀浆→离心→过滤→测粗酶含量→测酶活性
1) 原料处理、腌制将新鲜鳜鱼解剖清理，采用浓度为2%淡盐水室温下腌制(分别腌制1 d，3 d，5 d，7 d，9 d)，取鱼肚和鱼背处鱼肉进行以下实验。
2) 研碎、匀浆称取鱼背和鱼肚处鱼肉各5 g，捣碎后，放入100 mL的烧杯，分别加入缓冲液A 50 mL，冰浴条件下，3000 r均浆15 s。
3) 离心、过滤 将匀浆完全的溶液放离心管内，5℃、10,000 r、离心15 min，抽滤，得粗酶提取液，待用。
2.3. 酶活的测定
1) 酸性脂肪酶
参照文献 [6]。取0.1 mL粗酶提取液，加入2.8 mL缓冲液B，混匀后，加入0.1 mL、1.0 mM (g/mol)的橄榄油作底物，37℃水浴保温30 min后，立即用0.5 mL 95%乙醇终止反应，用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
2) 中性脂肪酶
参照文献 [6]。取0.1 mL粗酶提取液，加入2.8 mL缓冲液C，混匀后，加入0.1 mL、1.0 mM的橄榄油作底物，37℃水浴保温30 min后，立即在冰水浴中冷却，1 min内用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
3) 磷脂酶
参照文献 [7]。取0.1 mL粗酶提取液，加入2.8 mL缓冲液D，混匀后，加入0.1 mL、1.0 mM (g/mol)的橄榄油作底物，37℃水浴保温30 min后，立即用0.5 mL 95%乙醇终止反应，用荧光光度计在328 nm和470 nm处测荧光度。
分别用缓冲液B、C、D配制不同浓度梯度的4-甲基形酮溶液，作标准曲线，定义1 g酶在1 h内生成1 mmol 4-甲基形酮，即为一个酶活单位，记为U。
2.4. 各种缓冲溶液的配置
缓冲液A：精确称取三羟甲基氨基甲烷6.057 g，Na2HPO4 18.612 g，Triton X-100 1.0 g，500 mL容量瓶定容。
缓冲液B：精确称取柠檬酸7.163 g，Na2HPO4 2.101 g，Triton X-100 0.05 g，牛血清 0.08 g，100 mL容量瓶定容。
缓冲液C：精确称取三羟甲基氨基甲烷2.665 g，Triton X-100 0.05 g，置于100 mL容量瓶，定容至快到刻度线时采用37%盐酸溶液滴定至pH7.5。
缓冲液D：精确称取Na2HPO4 7.163 g，柠檬酸2.101 g，NaF 0.63 g，牛血清0.08 g，100 mL容量瓶定容。
3. 结果及分析
3.1. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性脂肪酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位酸性脂肪酶活性变化情况见图1。
Figure 1. Changes of acid lipase activity in back and belly muscles during the production of smelly mandarin fish
图1. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性脂肪酶活性变化情况
由图1可知，臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位的酶活性变化尽管不同，但趋势基本一致，都是初期酶活性(鱼肚18，鱼背16)开始逐渐升高，到达临界点(鱼肚55，鱼背50)时开始降低，最后趋于平缓状态(鱼肚22，鱼背20)。而鱼肚的酶活性在过程中略大于鱼背的酶活性。
3.2. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的中性脂肪酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位中性脂肪酶活性变化情况见图2。
Figure 2. The changes of the neutral lipase activity of the back and belly muscles during the process of the production of smelly mandarin fish
图2. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的中性脂肪酶活性变化
由图2可知，腌制工艺能显著提高臭鳜鱼肌肉中中性脂肪酶的活性。随着腌制时间的推移酶活性(初期，鱼肚19，鱼背17)升高趋势减缓(后期，鱼肚36，鱼背30)且肚部的肌肉酶活性大于背部肌肉酶活性。
3.3. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性磷脂酶活性变化
臭鳜鱼生产过程中鱼背和鱼肚部位酸性磷脂酶活性变化情况见图3。
Figure 3. Acid phospholipase activity of back and belly muscles during the production of smelly mandarin fish
图3. 臭鳜鱼生产过程中背部和肚部肌肉的酸性磷脂酶活性变化
由图3可知，臭鳜鱼肌肉中酸性脂肪酶活性在腌制工艺能显著提高(鱼肚3.420升至7.764，鱼背3.086升至6.891)。随着腌制时间的推移酶活性升高趋势减缓(鱼肚7.950，鱼背7.210)且肚部的肌肉酶活性大于背部肌肉酶活性，随着腌制时间的推移，酶活开始降低(鱼肚7.400，鱼背7.001)。从酶水解的反应物以及水解的类型来看，磷脂酶具有和脂肪酶相似的性质，但是这两种酶属于不同组酶，不属于丝氨酸水解酶一类的。
对于脂类物质前体而言，肉类的风味成分形成时，磷脂的贡献最大 [8]，磷脂酶尽管与脂肪酶归属不同组酶，但是二者的反应底物和水解方式相似。研究发现，腌制金华火腿时，温度及盐是影响磷脂酶活性的主要因子 [9] ；板鸭加工时，盐份及水活度可很好地调控脂肪酶与磷脂酶的活性 [10]。因此，研究臭鳜鱼加工过程中脂肪酶和磷脂酶活性变化，对调节臭鳜鱼加工过程中的水解，控制脂肪氧化，提高产品风味，意义较大。下一步，应考虑温度、盐份及水活度对臭鳜鱼加工的具体影响。
4. 结论
在加工臭鳜鱼过程中，腌制前期和中期，酸性脂肪酶活性、中性脂肪酶与酸性磷脂酶的酶活基本上处于上升阶段，酶活随着时间的增加而增加，到腌制后期，酸性脂肪酶的活性开始下降，而中性脂肪酶与酸性磷脂酶的酶活变化不大。此外，鱼肚部位这三种酶活比鱼背部位的稍高。
基金项目
2018年国家级大学生创新创业训练计划项目(201811305031)；2017安徽高等教育科学研究项目(KJ2017A567)；安徽省教育厅省级名师工作室(2016msgzs044)。
NOTES
*通讯作者。