1. 引言
大田基黄Lysimachia fortunei Maxim系报春花科排草属植物红根排草,别名星宿菜、红根草,系多年生植物,多发现于山边、沟坡、溪畔等湿润阴凉区域,在我国中南、华东等省均有分布。大田基黄全草富含黄酮类、甾体类化合物 [1] [2] [3] [4],具有抗高血压、镇痛抗炎、提高免疫力等药理作用 [5] [6] [7]。黄酮类化合物属于植物二次代谢产物,具有多方面的活性 [8],大田基黄富含黄酮类化合物 [9] [10],可能是潜在的抗病毒活性物质。本实验测定了大田基黄提取物中的总黄酮含量,利用HepG
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细胞系观察不同提取物对HBeAg、HBsAg分泌的影响,分析不同极性提取物的抗乙肝病毒功效。
2. 材料药品与仪器
2.1. 药品试剂
大田基黄全草,由广西植物研究所黄定中高工鉴定为报春花科排草属植物红根排草Lysimachia fortunei Maxim;芦丁标准品,AR,批号TCM027-080118,南京替斯艾么中药研究所;D101大孔吸附树脂(中国沧州远威化工有限公司);HepG
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细胞系(北京大学医学院第一附属医院病毒研究所);DMEM G418 (Gibco分装),谷氨酰胺(Sigma),新生小牛血清(Sigma);其他试剂为分析纯。
2.2. 仪器设备
BP211D电子天平,德国Sartorius公司产品;752紫外光栅分光光度计,上海分析仪器总厂产品;MCO
-15AC
CO2培养箱,日本三洋公司产品;XSBIA倒置显微镜,上海蔡康光学仪器有限公司产品;KHB ST-360酶标仪,上海科华实验系统有限公司产品;96孔细胞培养板,美国Corning公司产品。
3. 方法
3.1. 总黄酮提取
大田基黄全草粉碎,过14目筛,取过筛物20 g,加60%乙醇200 mL超声提取0.5 h,抽滤,滤渣按相同条件再提取一次,合并滤液,减压浓缩至稠状物。稠状物加500 mL蒸馏水搅拌溶解,静置过夜,抽滤。取滤液上D101树脂柱,待大孔树脂吸附完全后,用蒸馏水洗脱至馏出液无色,弃去此柱流液。再用400 mL 80%乙醇洗脱树脂,收集洗脱液,旋转蒸发仪减压浓缩,将浓缩液于真空干燥器中45℃干燥成疏松固体,粉碎得粗黄酮,备用。
3.2. 样品制备
干燥大田基黄全草粉碎,过14目筛,称取10 g用10倍量95%乙醇超声提取0.5 h,抽滤,滤渣同样条件再提取一次,合并滤液,浓缩、真空干燥得提取物E1;滤渣用60%乙醇按上述方法处理得提取物E2;上述滤渣用蒸馏水按上述方法处理得提取物E3。
3.3. 总黄酮的含量测定
3.3.1. 标准曲线的制备
精确称量20.00 mg芦丁标准品,以60%乙醇超声溶解后,定容至50 mL容量瓶,取8.0 mL于25 mL容量瓶中,加入浓度为0.50 mol/L的NaNO2 1.0 mL,摇匀静止5 min,再加入0.30 mol/L的AlCl3 1.0 mL,摇匀静置5 min,再加1.00 mol/L的NaOH 5.0 mL,摇匀显色后,用60%乙醇定容并摇匀,放置10 min,用1 cm比色皿在360~600 nm区间扫描,确定最大吸收波长为504.6 nm。分别移取上述标准液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于7个25 mL的容量瓶中,同上述方法显色后,用60%乙醇定容,于504.6 nm处测定吸光度,空白试剂为参比液,绘制标准曲线。
3.3.2. 精密度试验
取上述芦丁标准液5份,每份3.0 mL,分别置于25 mL容量瓶中,显色后用60%乙醇定容,测定5份溶液的吸光度值。
3.3.3. 稳定性试验
量取同一供试品溶液,分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h处测定吸光度值,每一时间段测5次,计算RSD%。
3.3.4. 样品中总黄酮含量测定
精确称量粗黄酮干燥产物120 mg,用60%乙醇超声溶解,定容至50 mL容量瓶。再精密量取5.00 mL于25 mL容量瓶,按标准曲线制备方法加入试剂显色摇匀后,用60%乙醇定容放置10 min,测定吸光度,测定3次,并将此值代入回归方程,计算总黄酮的含量。
3.4. 总黄酮的体外抗乙肝作用
3.4.1. 药物配制
将大田基黄提取物E1、E2、E3用100%二甲基亚砜溶解,使二甲基亚砜浓度为10%,过滤灭菌备用。
3.4.2. HepG2.2.15细胞的培养
DMEM中加入380 mg/L G418、15%新生小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素链霉素、5%碳酸氢钠调pH 7.2~7.4,于
37℃
、5%二氧化碳条件下培养,每10 d传代一次。
3.4.3. 药物对细胞的毒性作用试验
将HepG
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细胞按1 × 108/mL接种于96孔细胞培养板,每孔190 μL,置CO2培养箱培养30 min,酶标仪于波长515 nm条件下测其吸光度。依次将提取物E1、E2、E3各50 μL加入培养板中,每3 d换相同浓度的相同药液和培养基,设不加药物的100 mL/L DMSO为对照孔,于第9天测定药物对细胞的毒性。
3.4.4. 大田基黄提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响
将HepG
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细胞按2 × 105/mL接种于96孔细胞培养板中,每孔190 μL,加入不同浓度提取物E1、E2、E3,每个浓度设3个平行孔,同时设10% DMSO阴性对照组,3天后取培养孔上清液用ELISA法测定吸光度值,计算药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率。
3.4.5. 统计处理
各组检测数据以
± s表示,组间比较用t检验。
4. 结果
4.1. 方法试验
精密度试验:5份芦丁标准液,吸光值分别为0.135、0.135、0.135、0.136、0.135,平均值为0.1352,RSD% = 0.33,显示精密度良好。
稳定性试验:0~8 h不同时间点吸光度值RSD%分别为0.18、0.28、0.19、0.17、0.15、0.28、0.36、0.43、0.67,统计结果表明,在8h内试验结果稳定性良好,检测方法可行。
4.2. 黄酮含量测定
测定提取物中总黄酮含量3次,平均含量为89.29%。
4.3. 提取物对HepG
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细胞系的作用
大田基黄提取物体外抗乙肝病毒作用,提取物E1为60%乙醇提取物,提取物E2为大田基黄95%乙醇提取物,提取物E3为95%乙醇提取完后再用水提取。72h的抑制结果见表1、表2和表3。提取物对HBeAg分泌具有较好的抑制作用,对HBsAg的分泌作用影响有差异,仅提取物E2具有较好的抑制作用。三种提取物对HBeAg的抑制作用呈现剂量性关系,E2对HBsAg的抑制作用也呈现出抑制作用。
Table 1. Effects of extract E1 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )
表1. 提取物E1对HepG
2.2.15
细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3,
)
Table 2. Effects of extract E2 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )
表2. 提取物E2对HepG
2.2.15
细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3,
)
Table 3. Effects of extract E3 on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell lines (n = 3, x ¯ ± s )
表3. 提取物E3对HepG
2.2.15
细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3,
)
5. 讨论
乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致,肝脏感染后产生炎性病变,具有传染性。乙肝病毒感染者血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)呈阳性,是感染HBV的标志。乙型肝炎E抗原(HBeAg)是判断HBV复制活跃与否的重要标志,其存在于HBsAg阳性患者的血液中,HBeAg呈阳性反映HBV病毒复制活跃、传染性强。目前,抗乙型肝炎药物主要有α-干扰素和核苷类似物两大类,但是其治疗效果并不令人满意,而且具有类感冒、疲倦和低血球等副作用 [11] [12]。传统中药作为一种补充替代疗法,在临床上中国、日本和韩国等多个国家广泛应用其治疗乙型肝炎 [13]。传统中药活性因子复杂多样,很多活性因子没有完全分离纯化,结构没有阐明,但是由于其来源广泛,而且化学特征与生物合成或者化学合成药物类似,易吸收、代谢,因此近年来传统中药引起了药物研究者的广泛关注 [14]。
黄酮类化合物是一类发现于植物的酚型结构次生代谢产物,种类繁多,活性多样。多种黄酮被证实对乙型肝炎具有治疗作用,茶叶中富含EGCG,其能够破坏HBV DNA复制中间体的合成从而抑制HBV 复制,最终减少共价环状病毒DNA链的表达 [15]。汉黄芩素和5-甲氧基-(3,4-二氢-3,4-二乙酰氧基)-2,2'-二甲基-吡喃酮-(7,8,5,6)-黄酮降低HBsAg和HBeAg分泌水平,同时降低HBV DNA表达,从而抑制HBV复制 [16] [17]。苎麻叶提取物含黄酮类化合物,对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA表达都有显著抑制作用 [18]。
大田基黄中槲皮素含量达3.25 mg/g,总黄酮含量高达3.83%,黄酮含量丰富,以大孔树脂D101富集纯化效率较高 [9] [10]。已经鉴定的黄酮类化合物有5000多种,包括无糖基的苷元和连接有糖基的苷。不同黄酮类化合物极性不同,溶解于有机溶剂的特性也不同,苷元和连接较少糖基的苷极性小,容易溶解于高浓度乙醇溶液中,含有稍多糖基的苷极性中等,比较容易溶解于中等浓度乙醇溶液,当苷中糖基数目比较多时极性较大,比较容易溶解在水中。所以利用95%乙醇提取出极性较小的黄酮苷元和黄酮苷E1,60%乙醇溶液提取出中等极性黄酮苷E2,水提取出极性大的黄酮苷E3。
本实验以乙型肝炎病毒感染肝癌细胞得到的细胞系HepG
2.2.15
为体外研究模型,检测了HBsAg、HBeAg的表达水平,观察了大田基黄三种提取物不同浓度体外对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。结果表明,提取物E2、E3仅对HBeAg表达有抑制作用,提取物E1对HBsAg与HBeAg均有抑制作用,且其抑制作用呈现剂量依赖性。三种提取物极性不同,表明其所含糖基数目不等,但均对HBeAg有抑制作用,且抑制作用相差不大,从构效角度表明苷元糖基存在与否对HBeAg表达影响不大,糖基对HBeAg的抑制作用不是必须的。但是糖基的存在对抑制HBsAg表达存在较大差异,提取物E1极性较小,说明其含糖基数目少,有较好的抑制HBsAg表达作用,而提取物E2、E3极性较大,对HBsAg表达的抑制较弱,说明糖基的存在不利于抑制HBsAg表达。
基金项目
北部湾大学校级科研项目(2017KYQD223),广西高校科学技术研究项目(KY2015ZD086)。