1. 引言
当前肿瘤已经成为危害人类健康最严重的疾病之一，预计到2020年左右全球因肿瘤导致死亡的人数将达到2000多万，同时肿瘤发病率在我国也逐年上升 [1]。中医药以整体观和辩证论治为指导思想，在肿瘤的治疗上具有独特优势，其抗肿瘤作用的机理可能与细胞凋亡、基因转录、血管生成、肿瘤转移等生物过程相关 [2] [3]。最新研究发现，作为传统中药使用的米糠具有良好的抗肿瘤效应 [4] [5]，且其资源非常丰富。米糠为禾本科稻属植物稻Oryza sativa L.的颖果经加工而脱下的果皮，是稻谷加工的主要副产品，我国南方为主要产区，北方各省均有栽种，具有开胃、下气之功效，主治噎膈、反胃、脚气等 [6]。国内外研究表明，米糠中富含一些特殊的生理活性成分，如米糠多糖、谷维素、维生素E、植酸、γ-氨基丁酸、阿魏酸、α-生育酚等均被证实具有较强的生物活性 [7] [8] [9]。现代药理研究也发现这些生物活性成分具有抗肿瘤、降血糖、降低胆固醇、抗细菌感染和增强免疫力等多种药理活性 [4] [10] [11] [12]，但是米糠抗肿瘤的研究仍然非常局限，从分子及细胞水平阐述其机制的研究少见报道。网络药理学的兴起，为米糠分子机制的研究提供了捷径和新方法 [13] [14] [15]。同时我国也是“稻米生产王国”，稻谷年产量占世界稻谷总产量为35%左右，居世界首位，而目前米糠主要用于饲料加工，多数则被直接废弃，有效利用率很低，造成巨大的资源浪费 [16]。因此，本研究利用网络药理学的方法，对米糠活性成分可能抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移的作用靶点以及信号通路进行分析，以期探讨米糠抗肿瘤的分子机制，也为米糠资源的开发利用及深入研究提供参考。
2. 方法
2.1. 建立数据集
查阅及检索CNKI、PubMed和TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，构建米糠活性成分数据集。依据相似性分析，通过BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)和TCMSP数据库，建立米糠活性成分的作用靶点，然后通过GeneCard (https://www.genecards.org/)和OMIM (http://www.omim.org/)数据库，构建肿瘤相关的靶点数据集。
2.2. 网络构建及分析
PPI (http://www.genome.jp/kegg/)网络分析，将米糠的活性成分、作用靶点和交互蛋白对应的靶点绘制“成分-靶点-疾病”网络图，然后使用Cytoscape 3.7.0进行可视化分析，得到节点的拓扑参数值(Degree, Closeness centrality, Betweenness centrality)，以3个拓扑参数值均大于所有节点中位数值为筛选标准，筛选米糠抗肿瘤的核心靶点。STRING (https://string-db.org/)数据库进行蛋白互作网络分析。
2.3. 生物过程分析
利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)数据库进行GO和KEGG通路富集分析。
2.4. 绘制米糠抗肿瘤主要通路图
利用KEGG数据库的KEGG Mapper功能在与肿瘤相关的作用通路上标注核心靶点，阐释米糠多靶点、多途径协同抗肿瘤的分子机制。
3. 结果
3.1. 药物靶点和疾病靶点数据的筛选
最终得到了12个米糠的活性成分，结果见表1。筛选出693个靶点，并构建了米糠抗肿瘤的交互网络，用不同形状和颜色可视化，结果见图1。黄色表示药物与疾病共同作用的靶点，也是米糠抗肿瘤的重要靶点；红色表示米糠的活性成分；蓝色表示活性成分的作用靶点；紫色表示交互蛋白。
Table 1. Structure and target number of active components in rice bran
表1. 米糠活性成分及靶标
Figure 1. The “Compound-Target-Disease” interactive network of rice bran’s anti-tumor effect
图1. 米糠抗肿瘤作用的“成分–靶点–疾病”交互网络
3.2. 米糠活性成分抗肿瘤核心靶点拓扑参数
网络拓扑参数分析，得到节点的拓扑参数(Degree、Betweenness centrality和Closeness centrality)中位数分别为：6.5、0.0470和0.1480。通过筛选后，最终得到5个核心靶点，结果见表2，蛋白与蛋白的相互作用网络见图2。结果显示，这些蛋白彼此相互关联且彼此相互调节。
Table 2. Direct target related topological parameters of active components of rice bran in tumor therapy
表2. 米糠活性成分治疗肿瘤的直接作用靶点相关拓扑参数
Figure 2. Protein target interaction diagram of rice bran for tumor therapy
图2. 米糠治疗肿瘤的蛋白互作关系图
3.3. GO富集分析
GO富集分析，共得到24条生物过程，其中P值 ≤ 0.05的生物过程共有17条，结果见表3。结果表明，这些靶点与蛋白糖基化、β-连环蛋白复合物、离子通道、蛋白激酶等多种生物过程的调控相关，且这些生物过程与肿瘤的发生、发展密切相关。反映了肿瘤发病涉及体内多个生物过程的异常，同时表明米糠可能是通过调节这些生物过程发挥抗肿瘤效应的。
Table 3. Enrichment analysis of biological function of rice bran against tumor by GO
表3. 米糠抗肿瘤作用的GO生物学功能富集分析结果
3.4. KEGG通路分析
KEGG富集分析得到4条主要信号通路，结果表4。其中Hippo signaling pathway和Pathways in cancer通路均显示出具有直接或间接参与抗肿瘤作用，此结果与肿瘤发病机制紧密相关。图3为米糠活性成分对Hippo signaling pathway信号通路靶点标注图。
Table 4. Enrichment analysis of KEGG pathway in anti-tumor effect of rice bran
表4. 米糠抗肿瘤作用的KEGG通路富集分析结果
Figure 3. Target mapping of active components of rice bran in tumor-related pathways
图3. 米糠活性成分在肿瘤相关通路中的作用靶点标注图
4. 讨论
米糠是稻谷加工过程中的主要副产品，我国产量巨大，多数都作为动物饲料，其营养价值、药用价值、资源优势没有得到充分的发挥。国内外研究显示，米糠是一种具有广泛开发潜力的高附加值资源。随着科学技术的不断发展，对米糠中活性成分的研究也不断深入到医药领域。朱丽丹等 [17] 研究表明米糠多糖主要通过宿主介导提高抗肿瘤作用，在多糖诱导下，Raw264.7被激活，细胞吞噬能力、NO和TNF-α释放能力都被增强，巨噬细胞发挥细胞毒性抑制肿瘤细胞。单树花等 [4] 研究表明小米米糠中的活性蛋白抗癌细胞增殖的能力较强，且能显著诱导癌细胞凋亡。米糠中活性成分之一——阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生长，其机制可能是通过下调mTOR蛋白表达，抑制增殖蛋白Ki-67表达和促进凋亡蛋白Caspase-3 表达 [18]。向思亭等 [19] 研究表明γ-谷维素对H2O2致L02细胞凋亡具有保护作用，其作用主要是抑制氧化应激，增强ATP酶活力，减少DNA损伤及细胞周期阻滞。米糠中活性成分是通过多种信号通路实现抗氧化、抗肿瘤、降血糖和增强免疫力等作用，具体作用的靶点和分子机制又如何，关于这方面的研究报道较少。
本研究利用网络药理学的方法对米糠活性成分抗肿瘤的靶点和信号通路进行了分析，并构建了“成分–靶点–疾病”交互网络图，发现了4条主要信号通路，其中Hippo信号通路是一条抑制细胞生长的信号通路。在哺乳动物中，Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应因子YAP和TAZ，继而与细胞骨架蛋白相互作用，被滞留在胞质内，无法进入细胞核进行转录激活功能，从而实现对器官大小和体积的调控，因此Hippo信号通路抗肿瘤可能是通过抑制肿瘤细胞的生长发挥作用。本研究旨在为米糠资源的开发利用及深入研究提供参考，为实现米糠的高附加值奠定基础。
基金项目
贵州省职业教育质量提升工程计划(黔教办职成函[2019] 7号)。
NOTES
*通讯作者。