Cu₂O-ZnO纳微异质结构生物H₂S感知特性研究

Biological H₂S Sensing Characteristics of Cu₂O/ZnO Nano-Micro Heterostructure

摘要: H₂S是继NO和CO人们发现的第三种内源性气体信号分子，在生物体的很多生理过程中表现出非常重要的生物学活性，尤其在高血压、心脑系统疾病、2型糖尿病、结肠癌等疾病的诊断和治疗方面起着重要的作用。由于生物体内H₂S的浓度会随着某些慢性疾病病变程度不同而发生相应变化，因此生物体内H₂S的浓度可以看作这些疾病诊断与治疗的标志物，所以实现生物体内H₂S浓度的快速检测对人类健康具有重要的意义。本研究利用电化学原位组装方法，构建基于氧化亚铜和氧化锌的特殊纳微有序阵列材料，基于异质界面的电导调控、以及材料表面硫化反应，该纳微结构表现出优异的生物H₂S传感特性。因此提出一种生物H₂S标志物的快速检测方案，实现相关疾病的诊断与实时监测的目的。实验结果证实，基于该研究体系的生物H₂S检测范围为1~1000 μmol/L，且具有良好的线性关系，达到了人体实际检测的应用要求，在相关疾病的家庭式监测应用方面具有巨大的潜力。

Abstract: H₂S is the third endogenous gas signaling molecule discovered after NO and CO, showing very important biological activities in many physiological processes of organisms, especially in the diagnosis and treatment of hypertension, cardio-brain diseases, type 2 diabetes, colon cancer and other diseases. Since the concentration of H₂S in organisms will change with some chronic diseases, the H₂S in organisms can be regarded as a marker for these diseases, so the rapid detection of H₂S concentration in organisms is of great significance to human health. Cuprous oxide and zinc oxide based nano-micro ordered arrays were prepared by an in situ electrodeposition method. Based on the conductance modulation of the heterointerface and the surface vulcanization reaction of the material, the heterostructure shows excellent biological H₂S sensing characteristics. Therefore, a rapid detection scheme of biological H₂S markers is proposed to realize the diagnosis and real-time monitoring of related diseases. The experimental results confirm that the biological H₂S detection range based on this heterostructure is 1~1000 μmol/L with good linear relationship. It meets the practical application requirements of human detection, has a great potential in the application of home monitoring of related diseases. It meets the application requirements of human body, and has great potential in the application of home monitoring of related diseases.

1. 引言

H₂S是第3种被发现的重要的内源性气体信号分子，广泛参与机体内多种生理和病理过程，具有重要的生物学活性。其在许多疾病和机体保护方面具有重要的应用，例如：1) 治疗高血压，外源性H₂S同道复合体ruSUR1亚基细胞外N末端的两种残基Cys6和Cys26相互作用，增加K_ATP通道开放概率，产生血管舒张作用，可以降低机体血压约1.4~4.0 kPa [1] [2]；外源性H₂S与K_ATP介导抑制心肌细胞凋亡，可以明显增强心肌细胞的活性 [3]；研究发现H₂S还具有促进内皮细胞复制和迁移，从而可以促进内皮细胞重生和修复的能力，从而起到调节血管的形成和重塑的作用 [4]；2) 保护心肌细胞，近来研究表明H₂S能调节miRNA的表达从而对心肌细胞起到保护作用；S. Toldo等人发现H₂S通过miR-21依赖性减弱I/R，产生心肌细胞保护作用并抑制炎性体的形成和活化 [5]。miR-378可以减弱心肌细胞的损伤 [6]。通过大鼠心力衰竭模型，研究人员发现当大鼠血浆H₂S浓度降低时，升高血浆H₂S浓度可以减少心肌坏死面积、减少心肌细胞纤维化 [7] [8]；3) 治疗2型糖尿病，PPAR-γ可以激活脂肪细胞的分化并且对糖的代谢起到重要的调节作用 [9]。近代研究表明db/db糖尿病小鼠肝脏中PPAR-γ mRNA表达比正常C57BL/6小鼠高，通过对PPAR-γmRNA表达较高的小鼠注射不同浓度的NaHS，发现糖尿病小鼠肝脏中的PPAR-γmRNA表达都有所下降，证明H₂S可能通过降低PPAR-γmRNA的表达，从而改善2型糖尿病脂代谢紊乱和减少并发症的发生 [10]。除此之外生物H₂S还在冠心病、呼吸系统疾病、慢性阻塞性肺疾病等数十种疾病相关的信号过程方面发挥着重要作用，可以看作是这些疾病的生物监测标志物。大量研究发现，冠心病可以导致血浆中H₂S的含量下降49.56% [11]。而且在不同冠脉血管病变的分型中，血浆中H₂S含量随病变程度的加重而逐渐降低。这一研究进一步证明了H₂S参与了冠心病的发病过程 [11]，因此实现血浆中H₂S浓度的监测对冠心病的诊断和治疗具有重要意义。

H₂S作为极易分解的气体分子，其在生物体内的浓度持续变化，因而难于准确检测。目前国内外检测生物H₂S的方法主要包括：高效液相色谱法、电化学法、气相色谱法、及荧光法等 [12] [13]。高效液相色谱法采用埃尔曼试剂对硫醇进行标记来实施检测，此方法的检测灵敏度高、性能稳定、可以实现对样品的批量检测。荧光法是通过测量待检测分子引起的荧光分子的荧光强度、寿命、光谱等参数的变化来实现测量。该方法在灵敏度、生物H₂S选择性和测量各种生物活性物质等方面具有显著的优势。化学传感器是利用H₂S气体分子在传感器的敏感电极上发生电化学反应，这种反应导致传感器的输出电信号发生改变，通过测量这个改变值的大小来反应气体浓度的变化。上述方法存在仪器操作复杂、检测价格昂贵、检测时间较长、甚至生物巯基化合物对信号的干扰不能完全克服等缺点，无法满足便携、快速检测技术的要求。

哺乳类动物体内的H₂S生理含量约为20~160 μmol/L，其中1/3以气体形式存在，其余2/3以HS^-形式存在。HS⁻与体内的H⁺结合可以生成H₂S，从而维持H₂S气体和HS⁻的动态平衡 [14]。因此若能实现对生物样品中HS⁻的检测，就可以实现水溶性生物H₂S标志物的检测，并达到克服其他生物巯基化合物干扰的目的。研究表明，HS⁻与Cu_xO接触会生成金属性Cu_xS [15]。这一化学反应比H₂S气体在材料表面的吸附反应过程更强、更稳定。所以构建针对生物信号表达的Cu_xO基二维纳微异质结构材料成为实现生物H₂S分子快速检测的关键。

Cu₂O是一种能带间隙为2.17 eV的P型半导体材料，因其毒性低、良好的压电性和催化性等优点，被广泛的应用在光催化、气敏检测和电化学储能、光电转化等领域。Lee等人证实了CuO-ZnO异质结构纳米材料对H₂S具有优异的敏感特性，200℃时5 ppm浓度的H₂S的敏感度可以达到83.84%。Hien等人利用射频磁控溅射技术构建的棒状和树枝状的纳微氧化亚铜材料对H₂S呈现出优秀的气敏特性 [16]。本团队通过电化学沉积法构建的Cu₂O/SnO₂异质结构薄膜在室温下对H₂S气体表现出极好的敏感性 [17]。同样方法制备的Cu₂O/Co₃O₄纳微异质结构在−30℃的条件下对H₂S气体仍具有极高的敏感性 [18]。由于电沉积法制备的金属氧化物纳微材料因具有良好的结构可设计性和易于功能化的特点，使其在生物传感应用方面显示出广阔的应用前景。但目前二维金属氧化物纳微结构的快速生物H₂S检测方面的研究还鲜有报道，传感机理和器件设计还有待进一步研究。

本文提出了一种可用于生物H₂S快速检测的Cu₂O-ZnO纳微异质结构阵列材料，并对其电化学原位组装过程和构建原理作了详尽描述。此外，对生物H₂S的检测性能表征证实，Cu₂O-ZnO纳微异质结构对生物H₂S浓度的响应范围为1~1000 μmol/L，完全覆盖人体血液H₂S的浓度(20~160 μmol/l)范围，其响应度可以达到4个数量级，且具有良好的线性关系。本文还进一步阐述了Cu₂O-ZnO纳微异质结构检测生物H₂S的原理和反应过程，并对其检测结果做了讨论与分析。

2. 实验试剂与方法

实验试剂包括硝酸锌(Zn(NO₃)₂)、硝酸铜(Cu(NO₃)₂)和硝酸(HNO₃)。配制电解液时，首先在超净烧杯中加入40 mL去离子水，并精确称量Zn(NO₃)₂和Cu(NO₃)₂各0.3750 g和0.4832 g，并依次加入去离子水中，再滴加20 μL的HNO₃，经过超声处理使其完全溶解，形成均匀的电解液。电解液中Zn²⁺和Cu²⁺的浓度分别为0.03 mol/L和0.05 mol/L。

在生长室内将两个厚度为20 μm的Cu金属电极平行的放置在硅片上，其平行间隔约为8 mm，滴加少许Zn(NO₃)₂和Cu(NO₃)₂电解液，轻轻盖上盖玻片，开始缓慢降温至−1.3℃，在硅片基底和盖玻片之间形成一块单晶冰，保持温度放置40分钟后开始电沉积过程。

沉积开始时，向电极施加频率800 mHz、幅度400 mV、偏置为250 mV的半正弦电压，Cu²⁺和Zn²⁺在沉积电场的作用下向阴极迁移，并在沉积界面被还原。后续的Cu²⁺和Zn²⁺不断被还原并堆积到沉积物的最前端，使沉积界面不断向阳极移动。Cu²⁺和Zn²⁺在半正弦沉积电势的不同振幅位置处被选择性的沉积、组装，最终构建出Cu₂O-ZnO纳微异质结构。

通过离子溅射仪，在模版的辅助下对Cu₂O-ZnO纳微异质结构表面进行Au金属溅射，将样品连接入电路。随后利用电学测试系统对其性能进行表征，系统地测试样品对生物H₂S的探测性能(包括敏感度、线性响应范围、选择性等)。

3. 结果与讨论

Cu₂O-ZnO纳微异质结构是利用电化学原位组装方法制备的，电沉积过程中通过施加周期性的半正弦波形电势实现Cu₂O和ZnO的选择性沉积。由于Cu²⁺的沉积电压相较于Zn²⁺沉积电压较小，因此在低电压时Cu²⁺优先沉淀形成Cu₂O纳米颗粒。伴随着电压的增大，Zn²⁺开始沉淀形成ZnO纳米颗粒，反应过程主要包含以下几个反应过程：

${\text{NO}}_3^{-}+{\text{H}}_2\text{O}+2{\text{e}}^{-}={\text{NO}}_2^{-}+2{\text{OH}}^{-}$ (1)

${\text{2Cu}}^{2+}+2{\text{e}}^{-}+2{\text{OH}}^{-}\to {\text{Cu}}_2\text{O}+{\text{H}}_2\text{O}$ (2)

${\text{Zn}}^{2+}+2{\text{OH}}^{-}\to \text{Zn}{\left(\text{OH}\right)}_2\to \text{ZnO}+{\text{H}}_2\text{O}$ (3)

因此基于以上分析，电化学沉积法制备Cu₂O-ZnO纳微异质材料的构建过程可分为几步：首先在低电位时 ${\text{NO}}_3^{-}$ 被还原成 ${\text{NO}}_2^{-}$ 并产生 ${\text{OH}}^{-}$，为后续金属氧化物的生成提供碱性环境；然后Cu²⁺在电极表面被还原生成Cu₂O纳米颗粒附着在电极表面；电压较高时，Zn²⁺与 ${\text{OH}}^{-}$ 发生电化学反应最终生成ZnO附着在Cu₂O周围形成Cu₂O-ZnO纳微异质结构，电化学过程如下图1所示。

Figure 1. Schematic diagram of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructure material formation

图1. Cu₂O-ZnO纳微异质结构材料形成示意图

本实验利用电化学沉积方法构建特殊Cu₂O-ZnO纳微异质结构材料，Cu₂O-ZnO纳微异质结构形貌的扫描电子显微镜(SEM)图像如图2所示。图中可以看到样品呈竹节样排列，使得样品具有较大的比表面积和结构重复性，这对于器件的构建与性能标准化具有很大的优势。

利用X射线光电子图谱(XPS)对Cu₂O-ZnO纳微异质结构进行表征，分析其表面元素组成以及元素价态情况。图3(a)~(c)为Cu₂O-ZnO纳微异质结构中Cu、Zn、O的XPS谱图。在图3(a)可以看出，Cu 2p在950.7 eV和930.7 eV的位置有两个较强的信号峰，分别对应于Cu的Cu 2p_1/2和Cu 2p_2/3的峰位，对应着Cu₂O中的Cu⁺元素。从图3(b)可以明显地看出Zn在1043.65 eV和1020.55 eV的位置有两个较强的信号峰，分别对应于Zn的Zn 2p_1/2和Zn 2p_3/2的峰位，与ZnO的结合能相一致。如图3(c)所示，O 1s的特征吸收峰在530.25 eV，表明该纳微异质材料中O的存在形式主要为晶格氧，且存在一定氧空位。由于样品本身电阻较大约为10⁶~10⁷ Ω，电极和材料之间的接触电阻较小约为几百欧姆，相对于我们样品的电阻很小，所以用四电极法和两电极法测量结果无明显区别。因此在室温条件下，利用四探针测试仪对构建出的Cu₂O-ZnO纳微有序阵列传感器的生物H₂S感知性能进行表征，滴加1000 μmol/LNa₂S溶液前后测得的I-V曲线如图3(d)所示。未滴加Na₂S溶液时，测得传感器的导电性较差，电阻为10⁶ Ω数量级。这主要是因为半导体纳微异质结构具有许多Cu₂O-ZnO的异质界面，界面势垒在载流子输运过程中的阻碍作用使得材料的导电性降低很多。加之Cu₂O和ZnO均为半导体，本身导电性就不理想。在滴加Na₂S溶液180 s后，传感器的导电性迅速增强，I-V曲线明显变陡，电导率提升了4个数量级。

Figure 2. SEM imageof Cu₂O-ZnO nano-microheterostructures

图2. Cu₂O-ZnO纳微异质结构材料的SEM图

Figure 3. XPS spectra of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructure. (a) Cu 2p; (b) Zn 2p; (c) O 1s; (d) The I-V curves of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructure with/without 1000 μmol/LNa₂S analyte

图3. Cu₂O-ZnO纳微异质结构中。(a) Cu 2p；(b) Zn 2p和 (c) O 1s的XPS谱图；(d) 滴加1000 μmol /L Na₂S溶液前后Cu₂O-ZnO纳微异质结构的I-V曲线

图4(a)中的曲线关系为硫化钠浓度与响应度的线性关系图。从图4(a)所示，Cu₂O-ZnO纳微异质结构对水溶性硫化氢浓度的响应在1~1000 μmol/L范围内呈现线性特点，该浓度完全覆盖了人体正常H₂S浓度(20~160 μmol/L)的范围，证明该纳微异质材料可以用于人体生物H₂S的检测。Cu₂O-ZnO纳微异质结构对可能的干扰物的响应度如图4(b)所示。在溶液浓度为1000 μmol/L、响应时间为180 s的同一条件下，Cu₂O-ZnO纳微异质材料为对Na₂S的响应度为24558，对碳酸氢钠、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、谷胱甘肽及半胱氨酸溶液的响应度在8~72之间。显然Cu₂O-ZnO纳微异质材料对生物H₂S具有更好的响应度，体现出了优异的选择性。生物H₂S检测结果响应度R的定义为：R = I/I₀，其中I₀和I分别是滴加Na₂S溶液前后的电流值。

Figure 4. (a) Response dependance of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructures on concentration of Na₂S; (b) Specific H₂S sensitivity of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructures

图4. (a) Cu₂O-ZnO纳微异质结构对Na₂S溶液的响应度对其浓度的依赖关系；(b) Cu₂O-ZnO纳微异质结构的H₂S选择性表征

Cu₂O-ZnO纳微异质结构对生物H₂S的优异敏感特性与材料的表面硫化反应是分不开的。Cu₂O-ZnO纳微异质结构与Na₂S溶液接触后，Cu₂O与溶液中的S²⁻/HS⁻发生硫化反应生成Cu₂O/Cu_xS_y覆盖在Cu₂O的表面形成Cu₂O/Cu_xS_y核壳结构，外壳Cu_xS_y进一步反应生成金属性CuS，反应过程如图5所示。

Figure 5. Schematic illustration of CuS formation on Cu₂O-ZnO nano-structure surface

图5. Cu₂O-ZnO纳微异质结构表面CuS形成示意图

图6中虚线表示载流子的运动轨迹，由于Cu₂O-ZnO异质界面势垒在载流子移动的过程中起到阻碍作用，载流子在Cu₂O-ZnO界面处移动受阻，因此材料表现出较差的导电性。当表面发生硫化反应之后，由于金属性质的CuS导电通道的形成，使得载流子的导通性大大增强，材料的导电性能大幅提升，表现出对生物H₂S的敏感特性，响应过程示意图如图6所示。

Figure 6. Schematic illustration of biological H₂S sensitivity mechanism of Cu₂O-ZnO nano-micro heterostructures

图6. Cu₂O-ZnO纳微异质结构的生物H₂S敏感机制示意图

4. 结论

我们通过电化学沉积方法构建了基于Cu₂O-ZnO纳微异质结构材料，结合对纳微异质材料的结构设计，充分发挥了各组分的敏感特性，结合异质界面电导调控、可逆硫化反应、阵列等优势，得到了高性能的水溶性生物H₂S敏感材料，并构建类似血糖测试试纸的快速检测元件，实现了生物H₂S的快速检测，获得了相应以生物H₂S为标志物的疾病检测技术突破。本研究为获得灵敏、快速、准确的临床及家庭式疾病检测方法提供了新思路。

基金项目

感谢国家自然科学基金资助项目(项目编号：11704168，11404158)、以及山东省基金项目(项目编号：ZR2016HB59)。