人STRA6基因克隆及其在肝癌细胞中的表达定位

Human STRA6 Gene Cloning and Its Expression and Localization at Hepatoma Cells

摘要: 克隆人STRA6基因蛋白编码区，构建STRA6基因真核表达载体并表达于肝癌细胞，分析其在肝癌细胞中的定位。用TRIzol法从人肝细胞QSG-7701中抽提获得总RNA，经RT-PCR和高保真PCR获得人STRA6基因蛋白编码区，并进行测序鉴定；用基因工程技术构建真核表达载体pDsRed1-STRA6，用脂质体法转染人肝癌细胞Hep 3B；蛋白免疫印迹检测肝癌细胞中STRA6蛋白的表达情况，激光共聚焦显微镜分析STRA6在肝癌细胞中的分布。成功克隆人STRA6基因的蛋白编码区，构建真核表达载体pDsRed1-STRA6并使其表达于肝癌细胞中，发现STRA6在肝癌细胞中表达后集中于细胞表面一个区域。本研究成功克隆STRA6基因并证明其在肝癌细胞表面分布具有区域性。

Abstract: To clone human STRA6 gene and construct its eukaryotic expressional vector to express target gene and to investigate its localization in hepatocellular carcinoma cells (HCCs). Total RNA was extracted from human liver cells QSG-7701 by TRIzol method, and the coding region of human STRA6 gene, identified by DNA sequencing, was obtained by RT-PCR and high fidelity PCR. Then, the eukaryotic expressional vector pDsRed1-STRA6 was constructed by genetic engineering technology and transfected into human hepatoma cell Hep 3B by liposome method. The expression of STRA6 protein in HCC cells was detected by Western blot, and the distribution of STRA6 in HCC cells was analyzed by laser scanning confocal microscopy. The coding region of human STRA6 gene was cloned successfully, and the eukaryotic expressional vector pDsRed1-STRA6 was constructed and expressed in HCC cells. It was found that the expressed STRA6 in HCC cells concentrated in one region on the cell surface. The STRA6 gene was successfully cloned and its protein distributed regionally on the surface of hepatoma cells.

1. 引言

维甲酸诱导基因6 (stimulated by retinoic acid 6, STRA6)也称MCOPS9、MCOPCB8、PP14296基因，是Bouillt等人通过全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导和差异筛选获得的 [1]。该基因定位于染色体15q24.1中，包含有20个外显子和19个内含子，编码667个氨基酸，其产物是一种9次跨膜蛋白，能通过结合细胞外视黄醇结合蛋白RBP4而捕获全反式视黄醇，促进视黄醇穿梭细胞膜，并将视黄醇转移到胞质视黄醇结合蛋白RBP1上 [2] [3]。STRA6不仅具有转运视黄醇的作用，还与肿瘤的发生发展具有密切的联系。有报道称，STRA6在结直肠癌、乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、卵巢癌和子宫内膜癌中的表达均有不同程度的上调，暗示STRA6可能还是一个癌基因 [4] [5]。为研究其在肝癌中的作用，本组首先克隆了STRA6基因的蛋白编码区，然后构建其真核表达载体pDsRed1-STRA6并通过脂质体法表达于肝癌细胞中，为研究其在肝癌中的作用奠定前期基础。

2. 材料和方法

2.1. 材料

细胞Hep 3B购自中科院上海细胞库；细胞QSG-7701购自上海赛百慷生物；细胞培养基DMEM和RPMI-1640购自GIBCO；胎牛血清购自Gemini；长链高保真G ´ L TaqDNA polymerase、反转录试剂盒、EcoR I、Xho I、Hind III、T4 DNA Ligase、凝胶DNA回收试剂盒、平末端加“A”试剂盒和克隆载体pMD18-T vector购自TaKaRa公司；小量质粒抽提试剂盒购自天根生物公司；引物合成及测序由上海生工生物完成；TRIzol、Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司；BCA定量试剂购自Pierce公司；STRA6多克隆抗体购自Affibiotech；红色荧光蛋白标签抗体和HRP标记的羊抗兔抗体购于Biogot；真核表达载体pDsRed1-N1保存于本实验室。

2.2. 设计引物

根据GeneBank中STRA6的基因序列(NM_022369)设计引物，并在5’末端和3’末端分别加入Xho I和EcoR I酶切位点。引物序列如表1所示。

Table 1. PCR primers for the coding region of human STRA6 gene

表1. 人STRA6基因蛋白编码区PCR引物

2.3. 细胞培养

QSG-7701细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养，Hep 3B用含10%胎牛血清的MEM培养，培养条件为37℃、5.0% CO₂。

2.4. RNA抽提和目的基因获取

用TRIzol法提取细胞QSG-7701中的总RNA，用反转录试剂盒合成cDNAs，并以表1中引物经高保真PCR扩增STRA6目的基因片段。琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收并纯化STRA6目的基因。

2.5. 构建真核表达载体pDsRed1-STRA6

将回收的STRA6基因片段末端加“A”后与克隆载体pMD18-T vector在4℃过夜连接，产物转化感受态DH5α，经含有青霉素的LB固体培养板筛选培养后，挑取单菌落与含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃摇菌12 h，抽提质粒并酶切鉴定，菌液送至上海生工生物测序。

测序正确的质粒和真核表达载体pDsRed1-N1分别用EcoR I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离目的片段并纯化回收，用T4连接酶16℃连接2 h，产物转化感受态细菌DH5α，用卡那霉素LB固体培养板培养，挑取单菌落扩大培养，经抽提质粒、酶切鉴定和DNA测序，重组正确质粒命名pDsRed1-STRA6。

2.6. 细胞转染

转染前12 h，将消化的细胞按30%的融合率铺于12孔板中，按Lipofectamine^TM2000说明书转染空载体pDsRed1-N1和含有目的基因的重组质粒pDsRed1-STRA6，转染6 h后更换培养基继续培养，转染后72 h在倒置荧光显微镜下观察转染结果。

2.7. 蛋白免疫印记

消化目的细胞并收集，用RIPA强效裂解液裂解细胞后对蛋白浓度用BCA法定量。用SDS上样缓冲液制备样品后进行SDS-PAGE，然后用电转移的方法将蛋白转印至PVDF膜上，再用5% BSA封闭30 min，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育4 h，ECL显色。

2.8. 蛋白定位分析

对转染外源质粒72 h后的细胞在荧光显微镜下进行观察，分析细胞是否出现红色荧光。荧光细胞用胰酶消化后重新铺板于盖玻片上，并继续培养细胞24 h以上，用4%的多聚甲醛室温固定细胞30 min，并用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，用激光扫描共聚焦显微镜分析STRA6蛋白定位。

3. 结果

3.1. 成功克隆STRA6基因蛋白编码区并构建真核表达载体pDsRed1-STRA6

以人肝细胞QSG-7701细胞cDNAs为模板，经高保真PCR获得长度约2 kb的STRA6基因片段(图1(A))，经测序后发现该DNA片段正是所需DNA片段，且未出现任何突变。用Xho I和EcoR I对真核骨架载体pDsRed1-N1和含有STRA6目的基因的T载体pMD18T-STRA6进行酶解切割，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的DNA片段(图1(B))。目的DNA片段经T₄ DNA连接酶连接、转化、卡那霉素筛选培养、质粒抽提和酶切鉴定，证明pDsRed1-STRA6与预期一致(图1(C))，DNA测序显示STRA6基因正确插入到真核表达载体pDsRed1-N1中，证明pDsRed1-STRA6正是所需重组质粒。

注：(A) PCR扩增STRA6基因蛋白编码区。(B) 限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I双酶切真核表达载体pDsRed1-N1和pMD18T-STRA6。(C) 限制性核酸内切酶酶切分析重组真核表达质粒pDsRed1-STRA6。

Figure 1. Cloning of STRA6 gene and construction of its eukaryotic expressional vector

图1. STRA6基因克隆及其真核表达载体构建

3.2. 外源STRA6融合蛋白成功表达于肝癌细胞

用脂质体法将重组质粒pDsRed1-STRA6导入肝癌细胞Hep 3B中，转染后72 h，细胞开始出现红色荧光(图2(A))。消化并收集细胞进行蛋白免疫印记检测，发现肝癌细胞表达外源STRA6融合蛋白(STRA6-DsRed1) (图2(B))，证明pDsRed1-STRA6可以在细胞中表达目的蛋白。

注：(A) 外源融合蛋白STRA6 (STRA6-DsRed1)在荧光显微镜下呈现红色。(B) 蛋白免疫印记分析外源STRA6在肝癌细胞中的表达情况。

Figure 2. Expression of exogenous fusion protein STRA6 in HCC cells

图2. 外源STRA6融合蛋白在肝癌细胞中表达

3.3. STRA6集中表达于肝癌细胞的细胞表面

为分析STRA6在肝癌细胞中的定位，将表达外源目的蛋白的肝癌细胞铺板于盖玻片上，经多聚甲醛固定和细胞核染色，用激光扫描共聚焦显微镜观察发现，STRA6的表达始于胞质囊泡，后集中定位于细胞膜某一区域(图3)。

Figure3. The expressed STRA6 was localized in a region of cell surface of hepatoma cell

图3. 表达的STRA6集中定位于细胞表面某一区域

4. 讨论

有研究显示，STRA6参与了多种临床上常见恶性肿瘤的发生和发展过程，而这些作用背后的分子机制也有所不同。如在结肠癌形成过程中，STRA6会与细胞外分泌型视黄醇结合蛋白4 (RBP4)结合，将胞外RBP4-维生素A复合物中的维生素A转运入细胞内，并传递给胞内STRA6结合蛋白RBP1，激活JAK-STAT信号通路，使下游STAT3磷酸化和二聚体化入核，并结合干细胞基因如NANOG，SOX2和OCT4等的启动子中的调控元件，促进这些干性基因表达，诱导结直肠细胞异常增生，最终诱导结直肠癌的发生 [6] [7]。另外，在胃癌发生过程中，STRA6因细胞内的miR-873表达受到抑制而升高，激活Wnt/β-Catenin信号通路，促进细胞增殖和癌变 [8]。这些研究均显示STRA6是一个典型的癌基因。

注：(A) TCGA数据库中STRA6在肝癌和正常肝组织中表达变化。**P = 4.743 × 10⁻⁷。(B) STRA6表达高低对肝癌患者存活率的影响。

Figure 4. The expression of STRA6 in liver hepatocellular carcinoma and its relative surviving rate in TCGA database

图4. TCGA数据库中STRA6在肝癌中的表达及其相关存活率

之前的研究一直认为STRA6不在肝细胞中表达 [9]。因此，对肝细胞中STRA6的功能和作用研究较少。但最新发表，鼠肝来源的肝细胞和人肝癌细胞均有表达STRA6 [10]。因此，现在有必要重新审视STRA6在肝细胞及肝癌发生中的作用。这一观点得到了Deng Z等人的支持 [11]。此外，TCGA数据分析结果同样显示，与正常的肝组织相比，肝癌细胞的STRA6表达显著升高，其中位表达值由肝细胞中的“0”变为“0.035”(图4(A)) [12]。对肝癌患者STRA6表达的高低差异将群体均分成2组，发现STRA6低表达组的存活率要高于高表达组。这些TCGA数据库分析结果显示STRA6在可能肝癌发生和发展中扮演癌基因的作用(图4(B)) [13]。因此，本课题组以人肝细胞QSG-7701的总RNA为模板，通过RT-PCR克隆并获得了STRA6基因的蛋白编码区，并通过基因工程技术构建了真核表达载体pDsRed1-STRA6，然后将其表达于肝癌细胞Hep 3B中，发现表达的STRA6在肝癌细胞中出现在囊泡结构中(图3)。由于STRA6是一个跨膜蛋白，而细胞膜蛋白的翻译和组装首先发生在内质网上 [14] [15]，因此推断STRA6所在的囊泡结构可能是细胞器内质网，表达后集中分布在肝癌细胞某一特定表面，并非均匀、散在地分布于细胞表面。这一推断有待于进一步实验验证。总之，本研究构建的STRA6基因表达载体及在肝癌中表达红色荧光蛋白融合的STRA6为我们接下来研究STRA6在肝细胞癌变和肝癌发展中的作用奠定了一定的前期基础。

致谢

感谢贵州医科大学基础医学科学研究中心对本研究提供的技术支持和平台服务。

基金项目

本研究由国家自然科学基金(81560390)、2020年国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号342)和2020年省级大学生创新创业训练计划项目(项目编号S202010660004)提供资助。

NOTES

^*共第一作者。

^#通讯作者。