1. 引言
虚汗停颗粒由黄芪、大枣、浮小麦、糯稻根、牡蛎(煅)等制成，具有益气养阴，固表敛汗的功效。用于气阴不足之自汗、盗汗及小儿盗汗等症的治疗，为卫生部药品标准《中药成方制剂》收载品种。为控制虚汗停颗粒质量，苏孝共等 [1] [2] 采用HPLC法测定了虚汗停颗粒中黄芪甲苷的含量，但虚汗停颗粒由多味中药材组成，其化学成分复杂，通过单一成分的检测来控制虚汗停颗粒质量的方法略显不足。然而HPLC指纹图谱作为中药整体质量评价思路的重要体现，已被广泛应用于中药质量评价 [3] - [10]。因此，本研究采用高效液相色谱(HPLC)对虚汗停颗粒进行指纹图谱测试分析，并采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)”、SPSS 22.0软件及SIMCA 14.1软件分别进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，以期为评价虚汗停颗粒的质量提供参考依据。
2. 材料与仪器
甲醇、乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸为分析纯(重庆川东化工有限公司)；水为娃哈哈纯净水；虚汗停颗粒(广州白云山A药业有限公司)，具体来源见表1。Waterse-2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，PDA检测器；HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；AL204-IC电子分析天平(瑞士METTLERTOLEDO公司)。
Table 1. Source and similarity of Xuhanting granules
表1. 虚汗停颗粒的来源及相似度结果
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱：DiamonsilC18 (250 × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)进行线性梯度洗脱，0~5 min (B：95%~95%)；5~10 min (B：95%~92%)；10~32 min (B：92%~70%)；32~35 min (B：70%~70%)；35~38 min (B：70%~40%)；流速1 mL/min；检测波长260 nm；柱温30℃；进样量10 µL。
3.2. 供试品溶液的制备
虚汗停颗粒适量，研匀后，取3.0 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇10 mL，超声提取30 min，放冷，定容至10 mL，摇匀，过滤，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
3.3. 方法学考察
3.3.1. 精密度实验
取同一批虚汗停颗粒样品按“3.2”项下的方法制备，在“3.1”项下的色谱条件下连续进样6次，进样量为10 µL，考察仪器的精密度。结果表明，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于3%，说明仪器的精密度良好。
3.3.2. 稳定性实验
取同一批虚汗停颗粒样品按“3.2”项下的方法制备，按“3.1”项下的色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样，进样量为10 µL，考察样品的稳定性。结果表明，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3%，说明样品在24 h稳定。
3.3.3. 重复性实验
取同一批虚汗停颗粒样品6份，按“3.2”项下的方法平行制备分析样品，按“3.1”项下的色谱条件分别进样，进样量为10 µL，考察实验方法的重复性。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，说明该方法的重复性良好。
3.4. 虚汗停颗粒指纹图谱的建立
按“3.2”项下制备供试品溶液，按“3.1”项下的色谱条件对12批有效期虚汗停颗粒样品及2批过期虚汗停颗粒样品进样检测分析，将所得到的色谱图数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，得到虚汗停颗粒HPLC指纹图谱，结果见图1~5。记录虚汗停颗粒HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表2，表3。
Figure 1. HPLC fingerprint of 14 batches of Xuhanting granules (S1~S2: expired Xuhanting granules; S3~S14: expired Xuhanting granules)
图1. 14批虚汗停颗粒HPLC指纹图谱(S1~S2：过期虚汗停颗粒；S3~S14：有效期虚汗停颗粒)
Figure 2. HPLC chromatogram of 14 batches of Xuhanting granules
图2. 14批虚汗停颗粒HPLC对照图谱
Figure 3. HPLC fingerprint of 12 batches of Xuhanting granules
图3. 12批有效期的虚汗停颗粒HPLC指纹图谱
Figure 4. Control spectrum of Xuhanting granules in validity
图4. 有效期的虚汗停颗粒对照图谱
Figure 5. HPLC fingerprint of two batches of expired Xuhanting granules
图5. 2批过期的虚汗停颗粒HPLC指纹图谱
3.5. 共有峰的确定
以保留时间约为17.939 min的峰为参照峰(有效期样品为8号峰，过期样品为13号峰)，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积。12批虚汗停颗粒有效期样品有16个共有峰，2批虚汗停颗粒过期样品有22个共有峰，12批有效期样品与2批过期样品比较有15个共有峰。结果见表2和表3，见图2、图4和图6。
Figure 6. Control spectrum of expired Xuhanting granules
图6. 过期的虚汗停颗粒对照图谱
3.6. 相似度评价
采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件自动匹配14批虚汗停颗粒HPLC色谱图相关参数，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，测得样品与对照指纹图谱之间的相似度，不同批次虚汗停颗粒相似度在0.896~0.975，详情见表1。
3.7. 14批虚汗停颗粒的聚类分析
将有效期与过期的14批虚汗停颗粒的共有峰相对峰面积数值导入SIMCA 14.1软件中进行聚类分析，宏观的聚类结果可分为2大类，S9、S10、S11、S12、S13、S14分为第1组，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分为第2组；而较为细微的聚类结果可分为5大类，S9、S10分为第1组，S1、S2分为第2组，S3、S4、S5、S6分为第3组，S7、S8分为第4组，S11、S12、S13、S14分为第5组。其中S1、S2为过期样品，其他为有效期样品，说明有效期与过期样品之间存在区别，同时也说明有效期样品之间也存在差异。结果如图7所示。
Figure 7. Cluster analysis results of 14 batches of Xuhanting granules
图7. 14批虚汗停颗粒的聚类分析结果
3.8. 主成分分析( PCA)
为了综合评价有效期与过期虚汗停颗粒之间的差异性，对虚汗停颗粒进行主成分分析。以14批虚汗停颗粒共有峰的相对峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件，采用非监督模式识别方法进行PCA分析，得到2大特征主成分PC1，PC2，结果见图4。从方差累计贡献率来看，建立的模型累计解释能力参数R2X、预测能力参数Q2分别为0.97，0.92，说明该模型的区分程度和预测程度都良好。前2个主成分分析已基本能反映有效期与过期虚汗停颗粒的主要特征。以主成分建立坐标系，得到14批虚汗停颗粒的PCA得分图和载荷图，结果14批虚汗停颗粒被分为3组，其中样品中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8可以归为1组，样品中S11、S12、S13、S14归为2组，S9、S10可归为3组。分析结果与宏观的聚类分析结果基本相同。见图8~10。
3.9. 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)
为更好地观察组间差异，基于主成分分析结果，采用监督模式识别方法进行组间的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。从方差累计贡献率来看，建立的OPLS-DA模型累计解释能力参数R2X、预测能力参数Q2分别是0.91，0.67，说明建立的数学模型稳定且预测能力较好。OPLS-DA载荷和得分矩阵，可明显看出有效期与过期样品集中在不同区域，与主成分分析(PCA)结果一致。根据OPLS-DA模型的VIP值来进一步筛选导致差异性的主要化学成分，结果见图11。一般认为VIP > 1的变量对分类起着关键作用，结果表明VIP值大于1的主要成分分别是15号峰、13号峰、14号峰、7号峰、3号峰。提示这些成分是有效期与过期虚汗停颗粒的主要差异成分。
Figure 8. Cumulative contribution rate of variance of the first and second principal components of 14 batches of Xuhanting granules
图8. 14批虚汗停颗粒第1，2主成分方差累计贡献率
Figure 9. PCA score of 14 batches of Xuhanting granules
图9. 14批虚汗停颗粒PCA得分图
Figure 10. PCA load diagram of 14 batches of Xuhanting granules
图10. 14批虚汗停颗粒PCA载荷图
Figure 11. VIP map of 14 batches of Xuhanting granules in OPLS-DA model
图11. 14批虚汗停颗粒OPLS-DA模型差异性标志物的VIP图
4. 讨论
实验过程中考察比较了乙醇、甲醇、50%甲醇等不同提取溶剂，同时也考察了回流、超声等提取方法，结果以50%甲醇超声提取，样品色谱峰数目较多，提取较完全，且操作简单；对色谱分离过程中的波长进行考察，结果表明在260 nm检测波长下基线平稳，信息量丰富，特征峰较明显，各峰分离度较好，故选择260 nm作为本实验的检测波长；对甲醇–水、甲醇–磷酸水、乙腈–水及乙腈–磷酸水等流动相系统进行比较，发现以乙腈–0.1%磷酸水为流动相系统能够获得较好的分离效果。同时考察了流速0.5 mL/min、1 mL/min、1.5 mL/min的流速，结果发现1 mL/min的流速下分离度和分析时间较好；考察了25℃、30℃和35℃的柱温，结果发现30℃时分离度较好。
本试验建立了虚汗停颗粒的HPLC指纹图谱并作相似度及共有峰比较，结果发现不同批次的虚汗停颗粒样品相似度在0.896~0.975之间，说明有效期与过期虚汗停颗粒样品之间较为相似，但通过共有峰比较发现，12批有效期样品有16个共有峰，2批过期样品有22个共有峰，12批有效期样品与2批过期样品比较只有15个共有峰，说明有效期与过期样品的色谱峰数量有差异，且过期样品的峰数目较多，可能与过期样品因放置时间过长导致一些成分发生转化、分解及产生新成分等因素有关。将14批虚汗停颗粒计算所得的相对峰面积进行聚类分析和主成分分析，结果发现聚类分析可将有效期与过期的虚汗停颗粒识别开来，也发现有效期与过期的虚汗停颗粒主要差异共有峰。本试验通过指纹图谱相似度、共有峰的信息及结合聚类分析与主成分分析结果，能够评价虚汗停颗粒的质量，为虚汗停颗粒质量控制及临床合理应用提供参考。
基金项目
贵州省一流课程重点建设项目(黔教高发[2017] 158)。
NOTES
*通讯作者。