1. 引言
骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种常见的严重老年性疾病，是一种全身代谢性骨病，以骨量减少、骨组织显微结构破坏，进而骨脆性增高和易发生骨折为特征 [1]。骨质疏松好发于老年人，其患病率随着人群年龄的增加而增高。我国是骨质疏松高发地区，60岁以上老年人骨质疏松患病率为36%，其中男性为23%，女性为49% [2]。随着人口老龄化局势的加剧骨质疏松患者逐渐增多，预计到2050年，我国的OP患者将增至2亿以上，骨质疏松症已经成为全球范围内广泛存在的公共健康问题 [3]。药物治疗是应对骨质疏松症积极且有效的手段，如雌激素、选择性雌激素受体(ER)调节剂、降钙素、双膦酸盐类、甲状旁腺激素、细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、选择性组织蛋白酶K抑制剂等 [4]。近年来，中医药治疗OP的疗效，特别是在改善患者疼痛及增加骨密度等方面的作用逐渐得到临床认可 [5]。中医以“肾”为人的先天之本，肾主藏精，精可生髓，髓则养骨 [6]。补肾壮骨经典中药山茱萸，在上千年的骨质疏松中医临证中被广泛使用 [7] ，《本草纲目》列山茱萸为滋补上品，云：“久服可黑发悦颜，轻身延年”，“能强阴益精，安五脏，通九窍，止小便利。久服，明目强身延年。治脑骨痛，疗耳鸣，补肾气，兴阳道，坚阴茎，添精髓，止老人尿不节”。山茱萸在中医中被用于骨质疏松的治疗，但是由于中药内活性成分的多样性与复杂性，目前对山茱萸治疗骨质疏松的具体作用机制尚不明确 [8]。生物信息学与网络药理学联合可以将中药成分的靶点与疾病的靶点科学地结合在一起，通过多种数据库可以系统地研究中药的复杂作用机制。本研究采用生物信息学及网络药理学的方法和理论，通过TCMSP、STRING等数据库，筛选预测山茱萸的主要化学成分及其潜在作用靶点，并构建与骨质疏松靶点的关联网络，进一步进行生物过程和通路富集分析。本文旨在阐明山茱萸治疗骨质疏松的分子机制，并为山茱萸的相关实验研究及临床应用提供科学可靠的预测依据。
2. 材料与方法
2.1. 筛选、预测山茱萸化学成分及作用靶点
利用现有数据库信息和生信技术对山茱萸化学成分及作用靶点进行挖掘。本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)预测中药药物、靶标和疾病之间的关系。在TCMSP数据库中检索“山茱萸”，其拉丁文为Cornus officinalis Sieb. Et Zucc.，在“Ingredients”模块查找到山茱萸在该数据库中的所有化学成分。山茱萸化学成分筛选参数设置为口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(druglike, DL) ≥ 0.18，并将筛选好的山茱萸化学成分保存下来。继续在TCMSP数据库的“Related Targets”模块复制所有山茱萸的靶点保存，利用Perl语言筛选对应化学成分的靶点，并且运用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)和Perl语言对靶点进行基因的注释，以方便于后续分析。
2.2. 获取骨质疏松疾病靶点
筛选出骨质疏松疾病的靶点是进行网络药理学的重要一步。本研究以“Osteoporosis”为疾病检索词，通过OMIM数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, http://www.omim.org/)以及GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)检索出所有与人类骨质疏松相关的作用靶点，筛选掉重复基因即可得到疾病靶点。
2.3. 成分靶点与疾病靶点相互作用
通过对山茱萸化学成分及作用靶点进行分析，结合骨质疏松疾病靶点的预测进行相互关系的建立。本研究运用R软件(vennDiagram包)确定山茱萸化学成分靶点与骨质疏松疾病靶点的交集，同时绘制韦恩图，并将其作为潜在的作用靶点。将对应的山茱萸化学成分及靶点运用Perl语言软件输出“network (网络关系)”“type (类型)”“molLists (成分列表)”三个文档，之后导入Cytoscape3.7.2软件中进行可视化操作，构建山茱萸活性成分–作用靶点网络图，从而预测出山茱萸参与治疗骨质疏松的活性成分及作用靶点。
2.4. PPI网络图
为明确山茱萸治疗骨质疏松的PPI网络中的关键靶点蛋白，将山茱萸活性成分作用靶点与骨质疏松疾病靶点交集所得基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)，限定物种物种为“homo sapiens”，获得山茱萸活性成分靶点PPI网络并分析得到核心基因，将成分–靶点基因输入Cytoscape3.7.2软件中的插件Biogenet，构建PPI网络后分析网络拓扑参数物种设置“homo sapiens”，“Data settings”设置“Protein ProteinInteraction”其数据来源主要包括生物通用知识库(BIOGRID)、相互作用蛋白数据库(DIP)、生物分子相互作用网络数据库(BIND)、分子交互数据库(MINT)、人蛋白质参考数据库(HPRD)和InAct。然后打开Cytoscape3.7.2软件中的插件CytoNCA，根据参数度中心性DC (degree centrality、介度中心性BC (betweenness centrality)进行筛选得到核心网络。
2.5. GO分析和KEGG通路富集分析
为进一步明确山茱萸治疗骨质疏松的生物学功能以及信号通路，首先运用R语言(org.HS.eg.db包)将调控网络的基因名称转化为基因的ID，然后利用R语言(colorspace包、stringi包、ggplot2包、DOSE包、clusterProfiler包、enrichplot包)对潜在作用靶点进行GO富集分析以及KEGG通路富集分析。从生物学途径( biological process，BP) 、细胞组成( cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)三个方面，并以p < 0.05为临界值，对潜在靶点进行GO富集分析。进一步运用Perl语言软件及Cytoscape3.7.2软件构建KEGG网络关系。从而预测出山茱萸治疗骨质疏松的潜在的信号通络，为山茱萸药理学研究提供一定的科学依据。
3. 结果
3.1. 山茱萸活性成分筛选
通过TCMSP数据库检测筛选得到山茱萸的活性成分，共226种化合物，符合OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18的活性成分共20种，具体如表1所示。其中Ethyl oleate (NF)、Leucanthoside、malkangunin、3,4-Dehydrolycopen-16-al、3,6-Digalloylglucose、gallic acid-3-O-(6’-O-galloyl)-glucoside、gemin D、lanosta-8,24-dien-3-ol,3-acetate这8种化合物于骨质疏松无潜在作用靶点。
Table 1. Bioactive components of Cornus officinalis and their OB and DL parameters
表1. 山茱萸生物活性成分及其OB和DL参数值
3.2. 山茱萸活性成分–骨质疏松作用靶点预测
通过OMIM、Genecards数据库检索骨质疏松相关的疾病靶点分别为42、4273个，筛出重复靶点共得到4305个疾病靶点，与TCMSP数据库中山茱萸12种活性成分的70个靶点取交集，共获得30个有关潜在靶点(图1(A))。并运用Cytoscape3.7.2软件构建山茱萸活性成分–骨质疏松作用靶点网络图(图1(B))，其中beta-sitosterol作用靶点16个，Stigmasterol作用靶点14个，Tetrahydroalstonine作用靶点11个，3者共同作用靶点3个：β2肾上腺素能受体(ADRB2)、前列腺素内过氧化物合酶1 (PTGS1)以及前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)。
Figure 1. Venn plot and network plot of the osteoporosis target-bioactive components of Cornus officinalis
图1. 山茱萸生物活性成分–骨质疏松作用靶点韦恩图和网络图
3.3. 构建PPI网络并筛选关键靶点
基于STRING数据库，将30个靶点基因上传后构建山茱萸治疗骨质疏松的PPI网络(图2(A))，得到核心基因PTGS3、CASP3、JUN (图2(B))。为进一步阐明山茱萸活性成分治疗骨质疏松的药理机制，将靶点输入Biogenet插件，建立潜在的靶点网络(2175个节点和42797个边缘)，将超过所有节点中值的节点视为是网络中的候选目标。根据插件CytoNCA的拓扑功能DC > 61识别候选目标得到靶点网络(421个节点和13,714个边缘)，进一步通过BC > 600筛选目标得到靶点网络(61个节点和856个边缘) (图2(C))。详细的拓扑特征和PPI网络如图2(C)所示。
3.4. GO功能富集分析
对山茱萸活性成分治疗骨质疏松的靶点从BP、CC、MF三个层面进行GO功能富集分析(P < 0.05，图3(A)~(C))，其中生物过程BP共有486个条目，前20条见图3(A)，发现与类固醇激素、氧水平反应、生殖结构发育、膜电位调节等有关；细胞组分CC分析中共有37个条目，前20条见图3(B)，主要包括膜筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、突触后膜组分(integral component of postsynaptic membrane)等；而在分子功能MF分析中共有59个条目，前20条通路见图3(C)，主要涉及类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、核受体活性(nuclear receptor activity)、肾上腺素能受体活性(adrenergic receptor activity)、儿茶酚胺结合(catecholamine binding)等通路。
Figure 2. Treatment of osteoporosis target and key target screening strategy; PPI network construction and screening of key targets
图2. 治疗骨质疏松靶点及关键靶点筛选策略；PPI网络构建并筛选关键靶点
Figure 3. GO analysis of active components of Cornus officinalis acting on osteoporosis targets. (A) BP analysis; (B) CC analysis; (C) MF analysis
图3. 山茱萸活性成分作用于骨质疏松靶点的GO富集分析。(A) BP富集分析；(B) CC富集分析；(C) MF富集分析
3.5. KEGG通路富集分析并构建KEGG关系网络图
通过R语言将基因的ID转化为基因名，并对其进行KEGG通路富集分析，共富集有60条通路，将其中前20个做成气泡图(P < 0.05，图4(A))，提示山茱萸发挥治疗骨质疏松的作用可能与神经活性配体受体相互作用、神经退行性变途径、小细胞肺癌、凋亡通路、p53 信号通路、IL-17信号通路等相关。进一步通过Perl语言提取KEGG信号通路中的相关靶点(PTGS2、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、RXRA、NOS2、CASP8、JUN、ADRB2、ADRA1A、OPRM1、GABRA1、ADRA2A、ADRB1、NR3C1、OPRD1、HSP90AA1、PLAU、AR、PTGS1、PGR、SLC6A3)和KEGG通路的ID(20个)，运用Cytoscape3.7.2软件构建KEGG关系网络图，并利用连接节点数目的不同定义图形的大小，以体现不同节点的重要性(图4(B))。
Figure 4. KEGG pathway of Cornus officinalis acting on osteoporosis target
图4. 山茱萸作用于骨质疏松靶点的KEGG通路
4. 讨论
在骨质疏松的治疗研究中，中药因其疗效显著、毒副作用小、适合长期使用而独具优势 [9]。目前越来越多的中草药被用于防治骨质疏松，作为收涩药，山茱萸被用于骨质疏松的治疗。国内研究学者许俊萍，陈涛 [10] 探索了山茱萸防治骨质疏松症的作用机制，通过分析山茱萸对小鼠骨质疏松模型骨形态学影响发现，山茱萸治疗组在骨皮质厚度、骨小梁面积、骨细胞数目等方面与空白对照组相比均有显著性差异，表明山茱萸确实能改善小鼠的骨质疏松状况。
本研究筛选出对山茱萸20种活性成分，并通过对12种有效成分的潜在靶点与骨质疏松潜在靶点进行预测，发现有30个共同靶点。活性成分–靶点网络图显示，β-谷固醇、豆甾醇、四氢鸭脚木碱等有效成分可以作用于多个靶点。相关研究结果表明 [11] ，β-谷甾醇能直接影响成骨细胞骨保护素与破骨细胞分化因子的比率(OPG/ODF)，促进成骨的进程，并且β-谷甾醇具有类雌激素的生物学功效，其可以诱导卵巢颗粒细胞E2的形成，进一步促进骨细胞膜雌激素受体结合，推动成骨作用。Srivastava等 [12] 研究发现，雌激素可通过抑制细胞核因子β受体活化因子配体的生物学活性，抑制破骨细胞的生物学活动，从而起到防止骨质疏松的作用。关键作用靶点有：β2肾上腺素能受体(ADRB2)、前列腺素内过氧化物合酶1 (PTGS1)以及前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)。1) 临床流行病学研究 [13] 表明，β肾上腺素能受体阻滞剂可以显著提高用药人群的骨密度、降低用药人群的骨折风险，Pasco等 [14] 在对569例发生意外骨折的女性患者使用β肾上腺素能受体拮抗剂，发现其能增加骨密度，降低骨折的危险性。国内学者通过体内、外模型研究得出：成骨细胞上的β2肾上腺素能受体影响骨形成指标胰岛素样生长因子I (IGF-I)mRNA的表达，间接影响了骨形成因子IGF-I的促进骨形成能力，从而调节骨代谢 [15]。2) 前列腺素内过氧化物合酶1以及前列腺素内过氧化物合酶2均为前列腺素合成的主要限速酶，前列腺素可以诱导巨细胞集落刺激因子以及RANKL的表达，促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞功能 [16] ，这可能是山茱萸重要作用靶点。3) 此外孕酮受体(PGR)与多个有效活性成分相关联，研究显示孕酮可使人成骨细胞和人成骨肉瘤MG-63细胞胰岛素受体底物(IRS)mRNA表达上调，低剂量激素补充治疗绝经后骨质疏松 [17] ，PGR也是山茱萸的重要靶点。
30个共同靶点通过STRING构建PPI网络，得到核心基因PTGS3、CASP3、JUN。其中Caspases3是一种具有切割蛋白供血的生物酶，这种酶会引起细胞结构崩解，当CASP3被激活时，细胞死亡将不可被逆转 [18]。刘嘉眉等 [19] 研究发现，CASP3影响绝经后骨质疏松症发病机制，在骨质疏松症组的案例中CASP3、CASP9含量增加，这表明在骨质疏松症的成骨细胞凋亡过程中，Caspases3依赖性凋亡途径激活。有相关研究结果表明 [20] ，药物的干预可以诱导相关信号通路及Caspases3的激活来引导软骨细胞的凋亡。进一步将靶点通过拓扑参数评估其中degree值前5的骨质疏松有关靶点为热休克蛋白90α-A1 (heat shock protein 90-alpha A1, HSP90AA1)、热休克蛋白90α-B1 (heat shock protein 90 alpha B1, HSP90AB1)、酪氨酸激酶受体1 (neu-rotrophic tyrosine kinase receptor type 1, NTRK1)、肿瘤蛋白p53 (Tumor protein p53, TP53)、泛素化连接酶E3蛋白(Cullin-3, CUL-3)，推测山茱萸主要通过这些潜在靶点发挥防治骨质疏松的功效。
通过GO功能富集分析，类固醇激素及其受体水平与山茱萸治疗骨质疏松相关程度较高。类固醇激素是由肾上腺皮质分泌的一类具有神经活性的甾体激素，由于类固醇激素可以抑制肠钙吸收及骨钙、磷重吸收，导致继发性甲状旁腺机能亢进，出现骨形成减少、骨吸收增，长期大量使用会给机体带来众多严重不良反应，尤其是骨质疏松症的发生往往不易被觉察 [21]。经GO功能富集分析，靶点PGR、NR3C2、RXRA、NR3C1、AR、PPARG富集提示山茱萸治疗骨质疏松主要通过调节类固醇激素机制，由于山茱萸有效成分β-谷甾醇具有类雌激素的生物学功效，其调节PGR机制有助于治疗骨质疏松，尤其是女性绝经后骨质疏松。其次研究显示，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞以及软骨组织上亦存在盐皮质激素受体，应用螺内酯等醛固酮受体拮抗剂干预后，骨形成增加，骨吸收减少，盐皮质激素对糖皮质激素引起的骨质疏松有调节作用 [22] ，NR3C1、NR3C2作为盐皮质激素受体编码基因提示山茱萸对于继发性骨质疏松，尤其是水盐代谢紊乱引起的骨质疏松具有特殊治疗靶点。
通过分析KEGG富集结果，筛选出山茱萸影响骨质疏松的相关通路有神经活性配体受体相互作用、神经退行性变途径、小细胞肺癌、凋亡通路、p53通路、IL-17信号通路等。KEGG富集分析得出，山茱萸治疗骨质疏松不仅包括上文分析的由类固醇激素受体(NR3C1、PGR、AR)以及肾上腺素能受体(ADRB1、ADRB2、ADRA1A、ADRA2A)参与的神经活性配体受体相互作用通路，凋亡通路以及p53通路在山茱萸治疗骨质疏松通路中也尤为重要。通过分析KEGG关系网络图，BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8作为重要的靶点参与凋亡通路以及p53通路，骨组织作为一种不断重建的组织，其数量很大程度取决于构成该组织的活性细胞数量，骨质疏松症的发生与骨系细胞的异常凋亡有关 [23]。CASP3、CASP9与绝经后骨质疏松症发病密切相关，在骨质疏松症组中的案例两者含量增加，这表明在骨质疏松症组的成骨细胞凋亡过程中，Caspases相关因子参与的凋亡通路发挥重要的生物学作用，进而影响骨质疏松发生发展进程，这有可能是山茱萸作用于靶点，从而对骨质疏松的发生发展进行干预。此外神经受体相互作用通路中雌激素可以促进破骨细胞以及破骨前体细胞的凋亡，从而维持正常的骨转换状态 [24] ，说明在治疗骨质疏松通路中神经受体相互作用通路与凋亡通路是息息相关的。
由以上可得知，本研究通过网络药理学分析显示山茱萸有多个活性成分，涉及到复杂的生物信息传导通路，揭示了山茱萸多成分–多靶点–多通路的特点。通过PPI的构建可以预测出山茱萸与骨质疏松相关的作用靶点蛋白，这是分析山茱萸防治骨质疏松的一个新思路。我们筛选出12种有效活性成分，30个治疗靶点，通过GO以及KEGG富集分析得出神经活性配体受体相互作用通路以及凋亡通路可能是山茱萸治疗骨质疏松的关键通路。此研究中，山茱萸治疗骨质疏松具体作用靶点还需要进行进一步的体内、体外实验水平的验证，其作用通路与预测的通路是否有对应均需要进一步实验才可以得到科学实践的支撑。生物信息学和网络药理学可以快速分析出药物靶点，为科学实践提供了循证证据，本文系统地阐明山茱萸治疗骨质疏松的干预和影响，为其临床应用及基础研究提供新的科学依据。
NOTES
*通讯作者。