1. 引言
松花粉在医学中又名松花，松属植物的单性花，是我国传统食药兼用的花粉品种，并于2014年列入国家中药材标准 [1]。研究发现松花粉营养成分和生物活性成分丰富，含多种蛋白质、氨基酸、酶、维生素、矿物质、核酸、黄酮类化合物、糖类化合物、胆碱、植物甾醇等200余种物质 [2] [3]，且搭配合理，营养均衡、全面，易于人体吸收。
松花粉中不仅含有大量的矿物质元素，可以有效补充人体的钙、铁、锌等，并且还对重金属离子具有一定的吸附性能 [4] [5]。松花粉中富含黄酮类、多酚类、维生素类物质，具有清除自由基、抗氧化和抑制肿瘤的功效 [6]。松花粉中膳食纤维含量很高，尤其是木质素，肠道内微生物无法消化大分子纤维类物质，有利于通便润肠 [6]。松花粉可通过调节机体的血糖和血脂的代谢。提高其糖耐量，缓解糖尿病症状 [7]。松花粉中的多糖和甾醇等物质可以调节血脂代谢 [8]。松花粉含有松树植株所具有的一切营养成分和生命活性物质，其成分稳定、易被机体吸收利用，具有延缓衰老的作用 [9]。
砷是一种对人体有害的类金属污染物。砷通过呼吸道、消化道和皮肤接触进入人体，如摄入量超过排泄量，砷就会在人体多数器官中蓄积，从而引起砷中毒。砷还有致癌作用，能引起皮肤癌。其化合物如氧化物和砷酸盐毒性较大，能够通过呼吸、饮水、食物等途径进入机体产生不同程度的毒性作用 [10] [11]。
总砷是松花粉一项重要的重金属污染物指标。对于松花粉总砷的限量要求，GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物的限量》 [12] 中明确规定了总砷含量最高为0.5 mg/kg，且标准中要求的检测标准为GB 5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》 [13]，前处理方法有湿法消解和干法灰化。
目前虽然有不同前处理方法在食品中的相关研究报道，但其研究基质主要是大米、海产品、油炸食品等，对松花粉中总砷的测定研究报道还没有。
本研究拟采用湿法消解和干法灰化两种方法分别对松花粉进行前处理，使用氢化物原子荧光法测定待测样品中总砷含量，分析比较两种不同前处理样品所测结果的精密度、准确度和检出限，从而得出适合松花粉中总砷检测的前处理方法。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
松花粉本地采购；砷：1000 mg/L，编号GSB04-1714-2004，国家有色金属及电子材料分析测试中心；实验用水Milli-Q去离子水，美国Millipore公司；所有前处理所用有机试剂均为国产分析纯。
SA710原子荧光光谱仪，北京普析通用仪器有限责任公司；0.1 mg分析天平，瑞士梅特勒公司；Research® plus 20~200 μL和10~1000 μL移液枪，德国Eppendorf公司；BGG-X8可调式电热炉，长沙实验电炉厂；马弗炉，美国CEM公司。
2.2. 实验方法
2.2.1. 试剂及标准系列溶液配制
还原剂：称取硼氢化钾10.0 g，氢氧化钠2.5 g，用超纯水溶解，定容至500 mL。
载流：5%盐酸溶液。
硫脲 + 抗坏血酸溶液：称取10.0 g硫脲，10.0 g抗坏血酸，用超纯水溶解，定容至100 mL。
标准溶液配制：通过逐级稀释砷标准储备溶液，配制成1 mg/L的砷标准中间液。取50 mL容量瓶，加入一定量1 mg/L的砷标准中间液，最后加入2.5 mL盐酸及4 mL硫脲+抗坏血酸溶液，纯水定容，混匀，配制成浓度为0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/L的标准系列工作溶液。
2.2.2. 样品前处理
1) 湿法消解
三个松花粉分别编号为1、2、3号，称取0.5 g样品(精确至0.0001 g)于100 mL高脚烧杯中，加入硝酸 + 高氯酸(4 + 1) 5 mL及1 mL硫酸，加盖玻璃表面皿放置过夜。次日，置电热板上消化完全，冷却至室温，加20 mL水赶酸至近0.5 mL，冷却后转入25 mL比色管中，加入硫脲+抗坏血酸溶液2 mL，用5%盐酸定容至刻度，摇匀，同时做试剂空白。
2) 干灰化法
称取0.5 g样品(精确至0.0001 g)于50 mL坩埚中，加入150 g/L的硝酸镁溶液2 mL及1 g氧化镁静置过夜，于电热板上加热炭化，炭化完全后置500℃马伏炉中灰化5 h，冷却至室温，加少许5%盐酸润湿灰分，加4 mL盐酸中和氧化镁，直至样品全部溶解，转入25 mL比色管中，加入硫脲+抗坏血酸溶液2 mL，用5%盐酸定容至刻度，摇匀，同时做试剂空白。
2.2.3. 仪器工作条件
砷空心阴极灯主电流30 mA，辅电流15 mA；负高压265 V；原子化器温度200℃；载气流量300 mL/min；屏蔽气流量600 mL/min；样品进样量1.0 mL；测量方法：标准曲线法；读数方式：峰面积；延迟时间1 s；读数时间15 s。
3. 结果与分析
3.1. 湿法消解温度的选择
湿法消解采用硝酸、高氯酸、硫酸3种混合强酸进行消解，能提高消解温度和消解效率，本实验在180℃、200℃、250℃、300℃、350℃的温度下对松花粉进行消化，发现300℃能将有机砷彻底分解成无机砷，由该消解方法得到的松花粉，加标回收率在91.8%~97.3%。
3.2. 湿法消解预还原剂的确定
无机砷的形态以砷(V)和砷(III)存在，而砷(V)不易形成挥发的砷化氢，直接用硼氢化钾还原不完全，造成测定结果偏低，需要加入足量的预还原剂才能确保As (V)完全转化为As (III)。且将高价态砷还原为三价砷需要一定的反应时间，预还原剂用量或预还原时间不足，也会导致测定结果偏低。本实验采用硫脲-抗坏血酸作为预还原剂，既提高了体系的还原能力，也延长了预还原剂的保存时间。实验表明，室温下加入100 g/L硫脲–抗坏血酸，放置30 min以上荧光强度趋于稳定。
3.3. 干灰化法覆盖层氧化镁用量的选择
氧化镁可以减少坩埚对样品的吸留，在碳化过程会快速燃烧造成砷吸收剂轻质氧化镁覆盖层的破坏，导致样品飞溅、砷化物挥发。本实验分别加入0.5、1.0、2.0、3.0 g的氧化镁，结果表明：当氧化镁浓度在1.0 g时，样品平行性较好，故本实验选择加入氧化镁的质量为1.0 g。
3.4. 载液与其浓度的确定
气态物发生需要一定的酸性环境，酸的浓度增大，荧光强度会明显增高，但酸浓度太大时荧光强度呈现下降趋势；酸浓度过低也会使砷的气态物无法形成。由于湿法消解的时候加入大量的硝酸，造成硝酸本底较高，故采用硝酸作为载液。本实验分别选取1%、5%、10%的硝酸作为载液。结果表明：硝酸浓度从1%升至5%，砷的荧光强度明显增高，当硝酸浓度继续升高至 10%时，砷的荧光强度有所减弱。因此本实验选择5% HNO3作为载液，在此条件下，既能得到较高的灵敏度，还减少了酸的用量，并获得满意的测定结果。
3.5. 硼氢化钾浓度的确定
在氢化物发生过程中，硼氢化钾作为还原剂对方法的灵敏度、准确度和稳定性有很大影响。硼氢化钾浓度过高，会产生大量的氢气，具有稀释作用，使荧光强度降低，方法灵敏度降低；浓度过低，还原能力差，气态物难以形成，灵敏度降低。本实验分别选取了5、10、20、30、40 g/L的硼氢化钾进行实验，结果表明：当硼氢化钾浓度在20 g/L时，荧光强度趋于稳定，故本实验选择硼氢化钾溶液浓度为20 g/L。
3.6. 线性方程
按照2.2.3设定仪器条件，仪器达到稳定后对0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg/L的砷标准溶液进行测定，以质量浓度作为横坐标、荧光强度作为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，砷在0~20 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为：If = 119.0676 * C − 9.8838，相关系数为r = 0.99986。式中If为荧光强度，C为质量浓度：μg/L。
3.7. 方法检出限
分别对采用湿法消解、干灰化法处理的试剂空白溶液进行11次连续测定，根据3倍标准偏差与对应的砷工作曲线斜率分别求出湿法消解、干法灰化的仪器检出限为0.0068、0.0046 mg/kg，满足国家标准GB 5009.11-2014总砷检出限(0.010 mg/kg)的要求。
3.8. 精密度
分别对3个松花粉样品采用湿法消解、干灰化法的6个平行进行测定，结果见表1。由表1可见，两种消解方法相比干法消解结果的分散性较大，相对标准偏差比较大(8.85%~9.04%)，湿法消解的重复性比较好，相对标准偏差范围为2.06%~2.86%，精密度高。
3.9. 回收率
3份松花粉样品中取6个平行分别加入与样品测定值接近的砷标准溶液，与样品一同湿法消解、干灰化法，上机测定。结果见表2。由表2可见，两种消解方法相比干法消解回收率低，范围为82.3%~86.0%，湿法消解的回收率较高，回收率为91.8%~97.3%，结果显示湿法消解相比较于干法消解更适应于松花粉中总砷含量测定的前处理。
Table 1. Method precision experiment
表1. 方法精密度实验
Table 2. Standard recovery experiment
表2. 加标回收率实验
3.10. 松花粉总砷含量测定
市面上随机采集20份样品，采用(1)湿法消解进行前处理，氢化物原子荧光法测定总砷含量。结果20分松花粉样品总砷最高值为0.195 mg/kg，最低值0.092mg/kg，均未超过GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物的限量》中总砷限量值(0.5 mg/kg)，说明松花粉中砷的含量满足要求。
4. 结论
湿法消解要注意的是湿法消解的混合酸体中硝酸的沸点为86℃，高氯酸的沸点200℃左右，硫酸沸点为338℃左右，消解要等高氯酸的白烟散尽，硫酸的白烟开始冒出，才能够冷却，加水赶酸，加水赶酸，否则消解液的酸度过高，影响测定结果 [14]。
经典的湿法消解，快速安全。优点在于，可凭经验控制温度和反应速度，样品处理速度快，方法设备普及。缺点是产生大量的有毒气体，试剂消耗量较大，空白值偏高。
干法灰化，试剂用量少，批处理样品量大，空白值低。缺点是干法消解结果低于湿法消解，原因可能是松花粉产品质轻，易燃，在碳化过程会快速燃烧造成砷吸收剂轻质氧化镁覆盖层的破坏，导致样品飞溅、砷化物挥发，另外坩埚对被测组分也有一定的吸收作用，容易导致测定结果和回收率偏低。同时由于灰化助剂本底较高，平行试验不理想，不适宜消解松花粉植物性水产品。
干法消化在结果误差大，相对标准偏差(RSD)值大，精密度差，回收率低。湿法消解法进行前处理的样品平行样结果误差小，精密度好，回收率高，准确度好；而且湿法消解在处理大批量样品时操作省时省力，更适合松花粉总砷检测前处理。
食品中砷含量的检测结果准确与否，不仅仅与样品的前处理密切相关，还取决于实验过程每一个环节，涉及实验室检测环境条件，同步的空白实验，化学试剂纯度是否符合实验要求，标准溶液是否做了期间核查及对比实验，仪器设备、玻璃量器是否经过检定及校正，仪器条件是否为最佳的测试条件，样品分析及数据处理等等。只有我们切实做好每一个环节的质量控制，才能保证食品中总砷测定结果的准确性。
NOTES
*通讯作者。