人ABO血型PCR与限制性片段长度多态性的遗传分析

Genetic Analysis of Human ABO Blood Type by PCR and Restriction Fragment Length Polymorphism

摘要: 由于三个等位基因I^A、I^B、i的不同组合，红细胞表面带有不同的抗原，因而ABO血型分为A型、B型、AB型、O型。其中A型血个体的基因型可能是I^AI^A或I^Ai，B型血个体的基因型可能是I^BI^B或I^Bi，因此，利用血清学方法无法直接判断A或B型血个体的基因型。根据I^A、I^B与i基因在序列上的区别，应用PCR与限制性内切酶片段长度多态性相结合的技术，可以进行人ABO血型的基因型鉴定。本实验用PCR-RFPL法对一名A型血个体进行基因型鉴定，并用测序进行验证。结果显示，PCR-RFLP法与测序得到的结论一致，说明该方法可行性较高。

Abstract: Due to different combinations of alleles I^A, I^B and i, red blood cells carry different kinds of antigens, for which there are four blood types: A, B, AB and O in the ABO blood type system. Genotype of indi-viduals with A blood type can be I^Ai or I^AI^A, and genotype of people with B type can be I^Bi or I^BI^B. As a result, we cannot know the genotype of people with A or B blood type directly by serological meth-ods. According to the difference of sequences between I^A, I^B and i, we can use PCR combined re-striction fragment length polymorphism method to identify genotype of human ABO blood type. In this experiment, we analyzed genotype of one individual with A blood type by PCR-RFLP and veri-fied the result by sequencing. The result showed that the conclusion of PCR-RFLP and sequencing method is coincided, which means that PCR-RFLP is feasible.

1. 引言

ABO血型系统是第一个被描述的红细胞血型系统，也是最具有临床意义的一个系统 [1]。ABO血型由I^A、I^B、i等位基因的组合决定，其中I^A、I^B基因分别编码N-乙酰半乳糖胺转移酶和D-半乳糖糖基转移酶，可以对抗原前体H进行不同的修饰，从而得到A、B抗原；i基因由于碱基缺失导致密码子移位，终止密码子提前出现，不能合成相关的酶，因此，抗原前体H保持不变 [2]。基因型为I^AI^B的个体为AB血型，ii的个体为O血型，I^AI^A或I^Ai的个体为A血型，I^BI^B或I^Bi的个体为B血型。

人的ABO血型在分析家谱、亲缘关系鉴定等方面有重要的作用，因此鉴定个体的ABO血型和基因型有重要的意义。利用带有A抗原的红细胞遇到A抗体会凝集，带有B抗原的红细胞遇到B抗体也会凝集的特性，可以将抗体加入到血液样品中，如果发生凝集，则待测个体有对应的抗原。根据个体的抗原的种类，可以确定其血型。AB或O型血的个体的基因型可以直接确定，但A或B血型的个体由于可能是杂合子或纯合子，基因型无法通过抗体凝集法确定。

ABO血型决定基因定位于9q34.1-9q34.2，包含了7个外显子和6个内含子。其中第6、7号外显子负责编码ABO糖基转移酶的催化结构域 [3]。本文采用Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)方法鉴定A或B血型个体的基因型。由于6号外显子上G258的存在，I^A或I^B基因与i基因相比，在这个位点多出了一个BstEII酶的酶切位点，而少了一个KpnI酶切位点 [3]。首先PCR扩增一段在I^A基因和I^B基因中完全相同且包含G258的DNA片段(i基因中对应的片段没有G258)，然后用限制性内切酶处理PCR产物，最后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带来判断PCR产物的成分，进而确定待测个体的基因型。

2. 实验材料

2.1. 实验用品

2.1.1. 试剂

人唾液DNA提取试剂盒购自上海生工；高保真PCR试剂购自擎科公司；引物由上海铂尚公司合成；PCR产物纯化试剂盒购自MACHEREY-NAGEL公司；DNA 10× loading buffer购自诺唯赞公司；BstEII和KpnI限制性内切酶购自NEB公司；DNA marker购自全式金公司。

2.1.2. 仪器与耗材

移液器，1.5 mL EP管，金属浴，PCR仪，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像仪，台式离心机，锥形瓶，药匙，电子天平，微波炉，NanoDrop2000超微量分光光度计。

3. 实验方法

3.1. DNA提取

分别收集一名AB血型个体、一名O型血个体和一名A型血个体的唾液，按照人唾液DNA提取试剂盒的使用说明书提取DNA。取250 uL唾液至1.5 mL EP管中，加入350 μL Buffer CL和20 μL Proteinase K，震荡混匀，65℃水浴20 min，间或混匀。向离心管中加入300 μL无水乙醇，充分混匀，然后将全部溶液和沉淀物转移至硅胶膜吸附柱内(吸附柱放入收集管中)，10000 rpm离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Wash Solution (已经加过乙醇)，10,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中溶液，将吸附柱放回收集管中，并重复一次。将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心2 min。取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入50 μL TE Buffer，静置3 min，12,000 rpm离心2 min，得到人唾液基因组DNA，并用NanoDrop2000测浓度。

3.2. PCR扩增

根据ABO血型基因6号外显子序列设计引物如下：

引物1：5’-GCTGCTTCGTTCTCTCCTCT-3’

引物2：5’-TGAACACAAGGAGAGACCTC-3’

这两个引物可以用于扩增一段包含G258的区域，序列长度为674 bp。设置4组PCR反应：#1组：用A血型个体的DNA样品作为模板；#2组：用AB血型个体的DNA样品作为模板；#3组：用O血型个体的DNA样品作为模板；#4组：用等量O血型个体的DNA样品和AB血型个体的DNA样品作为模板。每组配置两管50 uL反应体系。PCR反应条件：98℃预变性2 min，98℃变性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸10 s，35个循环，72℃延伸1 min。

3.3. PCR产物鉴定、测序和纯化

用1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间25 min。每管取1 μL PCR产物混合0.1 μL 10× loading buffer上样。如果出现目的条带，则每组各取一管送测序，另一管进行PCR产物纯化，用于后续实验。如果杂带较少，则直接纯化；如果杂带较多，则将剩余PCR产物电泳并进行凝胶回收。

用PCR产物纯化试剂盒进行凝胶回收。将剩下的4管PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间25 min。切下只含有目的条带的凝胶，放入1.5 mL EP管中，每100 mg凝胶加入200 uL Buffer NT1，50℃加热10 min，间或震荡。收集柱放入收集管中，将液体倒入收集柱中，11,000 g离心30 s。倒去废液，将收集柱重新放回收集管中。向收集柱中加入700 uL Buffer NT3，11,000 g离心30 s，倒去废液，将收集柱重新放回收集管中，并重复一次。11,000 g离心1 min，将收集柱放入干净的1.5 mL EP管中，EP管用70℃金属浴加热2 min。向收集柱中加入30 uL Buffer NE，室温静置1min，11,000 g离心1 min。得到纯化的DNA片段。

3.4. 酶切消化

分别使用BstEII和Kpn I消化4种纯化后的PCR产物。构建10 uL酶切反应体系和10 uL对照体系(后者除了将限制性内切酶换为等量的双蒸水之外，与前者完全相同)，37℃反应1 h。

3.5. 酶切结果检测

配制1%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间30 min。取9 μL PCR产物混合1 μL 10×上样缓冲液上样，根据条带判断基因型。

4. 实验结果

4.1. PCR-RFLP 鉴定结果

引物1和2用于扩增一段含有G258的片段，用于区分A或B基因与O基因。图1为PCR的电泳检测结果，可以看到每一管反应体系都出现了目的条带。A或B基因的PCR产物(以下简称pA)长度为674 bp，在G258的位置有一个BstEII酶切位点；O基因的PCR产物(以下简称pO)长度为673 bp，在缺失G258的位置有一个KpnI酶切位点。因此，pA被BstEII酶切为478 bp和196 bp的片段，被KpnI切为530 bp和144 bp的片段；pO无法被BstEII酶切，被KpnI切为334 bp、195 bp和144 bp的片段。不同基因型的个体的PCR产物由于含有不同的片段，在经过酶切后会有不同的电泳结果。表1为基因型对应的电泳结果，+表示会出现这个条带。注意表中标注的DNA片段的长度均为估计值，实际长度可能与这些值相差几个碱基，但这种微小的差异对琼脂糖凝胶电泳的结果基本没有影响。

PCR产物纯化前电泳检测，可以看到在700 bp附近都可以看到一条单一条带。

Figure 1. Results of PCR electrophoresis

图1. PCR电泳结果

Table 1. Genotype and enzyme digestion results

表1. 基因型与对应的酶切结果

本实验用O血型个体和AB血型个体的基因组样本作为对照，检测了一名A血型个体的基因型。AB血型个体的PCR产物(#2)中只有pA；O型血个体的PCR产物(#3中只有pO)；等量AB血型个体基因组和O血型个体基因组的混合物的PCR产物(#4)中有pA和pO，因而可以被看做A或B型血的杂合子的基因组PCR产物。图2为各组的PCR产物酶切后的电泳结果，其中#1为待测A型血个体的实验结果。从电泳结果可知，#1的结果总是与#2相同，所以待测A血型个体为纯合子，基因型为AA。

酶切电泳结果，+表示体系中加入酶，−表示将酶换为水。(a) BstEII酶切电泳结果；(b) KpnI酶切电泳结果。

Figure 2. Results of enzyme digestion electrophoresis

图2. 酶切电泳结果

4.2. 测序结果

#1、#2和#3的测序峰图清晰，无杂峰(如图3(a)、图3(b)和图3(c))。#1和#2中存在G258，说明二者中只含有pA；而#3中没有G258，说明#3中只含有pO。#4的G258的位置有G对应的黑色峰，但从G258的位置开始全都是杂峰，且多数位置是两个不同颜色的峰(如图3(d))。这说明#4中有两种DNA片段，且其中一种片段(即pA)有G258，另一种(即pO)没有，所以从G258的位置开始出现错位。#2、#3和#4的测序结果与之前预测的各组的PCR产物的成分对应。#1的测序结果与#2完全相同，说明待测的A血型个体为纯合子，基因型为AA，这个结果与PCR-RFLP实验的结果相同。

(a) #1的测序结果，红圈标出了G258；(b) #2的测序结果，红圈标出了G258；(c) #3的测序结果，没有G258；(d) #4的测序结果，虽然有G258，但从此开始出现杂峰。

Figure 3. Sequencing results

图3. 测序结果

5. 结语

ABO血型是一种重要的血型分类系统，在输血、刑侦、鉴定亲缘关系等领域有重要的作用。利用红细胞在相应的抗体的作用下可以凝集的特点，可以快速判断待测个体的血型。如果确定该个体为AB型血或O型血，则基因型可以直接确定；但如果该个体为A型血或B型血，则抗体凝集的方法无法判断基因型。对于A或B型血的个体，判断其基因型最好用判断等位基因种类的方法。随着分子生物学技术的迅猛发展，血型的基因检测研究也取得了突破性进展。有通过双链探针，采用实时PCR方法对个体进行ABO血型基因的分型，也有应用单管PCR，通过基因扫描(Gene Scan)的方法进行ABO血型基因的分型,还有采用分子信标的方法对ABO血型进行基因分型 [2] [4] [5] [6]。

国内许多高校在遗传学实验教学过程中也经常采用PCR-RFLP技术对ABO血型进行基因分型，并取得不错的教学效果 [7] [8]。在实际的教学过程中，我们发现由于PCR片段设计得过短，DNA酶切并电泳之后，小片段经常看得不是很清楚。因此，我们重新设计了引物，使PCR产物长度达到了674 bp，同时，选用了BstEII和KpnI对一份PCR产物进行酶切分型，简化了实验步骤，大大提高了成功率，所有的酶切分型结果同时用测序继续进行了验证，证实本实验方法切实有效。为了更方便地确定结果，在对AB血型DNA进行处理的同时也将等量AB型血的DNA与O型血DNA混合并处理。如果待测样本的酶切结果与AB型血DNA的酶切结果相同，则待测个体为纯合子；如果待测样本与混合DNA的酶切结果相同，则个体为杂合子。这样不仅方便确定结果，还可以证明AB型血的DNA的酶切结果与混合DNA不同的原因是二者的DNA成分不同，而不是某个反应体系中酶切不彻底。

无论是BstEII酶切，KpnI酶切，还是测序，结果都显示待测个体为纯合子。所以，任何一种方法都可以鉴定A或B血型个体的基因型。考虑到测序所需要的时间较长，所以推荐酶切法，且只需要一种限制酶进行反应就可以得出结论。

本实验在加深学生对ABO血型系统的了解的同时，锻炼了学生的动手能力和设计、优化实验方案的能力，比如PCR的过程可以让学生根据电泳鉴定结果判断反应体系和程序是否合适，进而掌握优化PCR反应的方法；学生考虑设计几组实验、每组实验如何设计的过程可以增强学生的逻辑思考能力。通过最终的实验结果，可以加深学生对复等位基因的理解，同时领会表现型与基因型的关系。本实验是上海科技大学遗传学实验课程的自主设计实验，旨在让学生通过自己设计实验，感受到科研的趣味性和实际用途，在实验成功后获得成就感，为之后的科研生活打下基础。