1. 引言
胃病是我国常见的胃肠道疾病,目前,中成药制剂逐渐受到越累越多患者的青睐。气滞胃痛颗粒在临床中应用广泛,由白芍、枳壳、柴胡、延胡索等成分组成,主要功效为舒肝理气、和胃止痛等 [1] [2],常用于治疗胃脘疼痛、肝郁气滞、胸痞胀满 [3]。其中,白芍作为重要组成成分之一,它具有养血调经、平肝止痛的作用,芍药苷为其指标成分 [4]。
目前近红外光谱技术在中药生产过程中应用较为广泛,能够快速检测,操作简单,能源消耗低 [5]。相比于传统的检测方法,近红外分析技术替代了人工,降低了人为主观带来的误差 [6]。本文以气滞胃痛颗粒提取液为样品,利用近红外光谱技术,建立气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷指标的定量分析模型,为扩大近红外在中药生产应用范围奠定了理论基础。
2. 实验材料与仪器
2.1. 仪器与试剂
气滞胃痛颗粒提取液(华润三九本溪药业有限公司);高效液相色谱仪(Agilent 1260);MicroNIR光谱仪(美国VIAVI);水浴锅(电热恒温水浴锅,220 V,50 HZ,上海精宏实验设备有限公司);梅特勒XS105DU型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);100 ml、250 ml锥形瓶;10 ml、25 ml容量瓶;进样瓶;一次性针筒;过滤头(尼龙,13 mm,0.2 μm,北京百灵威科技有限公2司);甲醇为分析纯;水为超纯水;乙腈为色谱纯;磷酸色谱纯。
2.2. 在线近红外光谱采集
气滞胃痛提取液光谱采集预处理:采集光谱前对提取液进行混匀均已后,采集近红外透射光谱。
光谱采集条件:扫描范围为908~1676 nm,扫描次数为100次,积分时间10.3 ms。气滞胃痛颗粒提取液原始光谱如图1所示。
Figure 1. Near infrared original spectroscopy of Qizhi Weitong granules
图1. 气滞胃痛颗粒近红外原始光谱
2.3. 气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷含量的测定
对照品溶液的制备:精确称量芍药苷对照品适量,加乙醇后制备成80 ug/ml溶液,即可。
供试品溶液的制备:取提取液约2 g,精确称量并记录,置于50 ml锥形瓶中加水,称重,室温下超声处理(功率250 W,频率50 kHz) 60分钟,冷却后再次称重,加水补充失去的重量,摇匀过滤,取滤液待用。
芍药苷含量测定:实验参考康绍建 [7] 等人的方法并做修改,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ul,注入液相色谱仪,测定。色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液为流动相B,检测波长为230 nm,梯度洗脱参考表1。
Table 1. Gradient conditions of liquid chromatography at different times
表1. 不同时间液相色谱梯度条件
2.4. 数据处理与模型性能评价
采集近红外光谱图后,运用VIAVI公司MicroNIR3.1数据分析软件中的偏最小二乘法建立气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷的近红外光谱与含量之间的校正模型。建立模型前,需要筛选出原始光谱中适宜的波段建立模型,这样能够快速提取光谱中的有效信息,缩短建模时间,减少计算量。由于仪器背景或环境会对近红外光谱产生一定影响,还需要对样品光谱进行平滑、微分等适宜的光谱预处理。
运用留一交叉验证法(Leave-One-Out Cross Validation, LOOCV),以交互验证误差均方根(Root Mean Square Error of Cross Validation, RMSECV)为指标,表征NIR结果与参照结果差异的标准误差 [8],通过预测残差平方和作为判别依据来确定最佳因子数。对校正集样本和验证集样本的预测误差分别用校正集误差均方根(RMSEC)、验证集误差均方根(RMSEP)、校正集相对偏差(RSEC)和验证集相对偏差(RSEP)考察。以模型决定系数(Determinate Coefficient, R2)来判断模型性能的好坏。建立的模型决定系数(R2)越接近1,说明样品实测值与通过模型得到的预测值之间越接近,进一步证明建立的校正模型稳定性好,预测能力强。当RMSEC和RMSEP值越小且彼此接近(一般在10%以内),表明模型具有好的稳健性。SEC和SEP亦是评价模型性能的重要指标,SEC和SEP值越小且彼此接近,说明模型的稳健性良好并且对未知样品的预测能力较强。
3. 结果与讨论
3.1. 气滞胃痛颗粒提取液芍药苷含量测定结果
对104个气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷的含量进行测定得出,芍药苷含量的范围0.16~1.80 mg/g之间。故有必要在气滞胃痛颗粒提取液生产过程对其芍药苷含量进行快速测定,从而及时判断出合格的气滞胃痛颗粒提取液投入大生产,提高生产效率,降低能源消耗(表2)。
Table 2. Paeoniflorin content of Qizhi Weitong granule extract sample
表2. 气滞胃痛颗粒提取液样品芍药苷含量
3.2. 光谱预处理
为提高近红外光谱的稳定性和准确性,需要对光谱进行预处理,常用的预处理光谱方法有一阶导数(1st)、二阶导数(2nd)、多元散射校正(MSC)、消除常数偏移量、矢量归一化(SNV)、Savitsky-Golay滤波平滑(S-G)和Norris导数滤波平滑等。本实验比较了在相同波长情况下不同预处理对气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷含量模型的影响,结果如表3所示。
Table 3. Effects of different pretreatment methods on the content model of paeoniflorin in Qizhi Weitong granule extract
表3. 不同预处理方法对气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷含量模型的影响
从表中可以得出,在光谱908.1~1676.2 cm−1内,分别对其进行去趋势化、一阶导数、矢量归一化 +去趋势化、二阶导数以及去趋势化 + 一阶导数处理后,当预处理方法为去趋势化时,得到的模型最优,其中,模型的R2为0.9793更接近于1,且模型的RMSEP值较低,RPD值较高。
3.3. 定量模型的建立
通过对气滞胃痛颗粒提取液得到的光谱进行异常点判断、光谱预处理和建模波段的处理后,最终得到提取液芍药苷含量分析模型,利用PLSR法建立提取液芍药苷含量的近红外定量校正模型,样品提取液芍药苷含量实测值与NIR预测值的相关关系如图2所示。
提取液芍药苷含量分析模型参数如表4所示,从表中可以得出在908.1~1676.2的波段范围内,光谱通过去趋势化预处理后,应用偏最小二乘法建立的近红外定量校正模型较好,模型校正集实测值与NIR预测值的R2为0.9793,RPD分别为4.9404,RMSEP分别为0.2006。
3.4. 定量模型的验证
为了进一步验证模型的预测能力,本研究根据3.3中所建立的模型来预测验证集样本。芍药苷含量的NIR预测值和HPLC法测得值的比较如图3所示,模型预测参数汇总见表5。
注:黑色点为参考值,红色点为预测值。
Figure 2. Correlation diagram of HPLC measured value and NIR predicted value of paeoniflorin in extract of Qizhi Weitong granules
图2. 气滞胃痛颗粒提取液芍药苷含量HPLC实测值和NIR预测值相关性图
Table 4. Summary of model parameters for paeoniflorin content in extract
表4. 提取液芍药苷含量模型参数汇总
Figure 3. Comparison between HPLC measured values and NIR predicted values
图3. HPLC实测值和NIR预测值比较
Table 5. Parameter table of prediction effect of paeoniflorin content model in Qizhi Weitong granules extract
表5. 气滞胃痛颗粒提取液芍药苷含量模型的预测效果参数表
从图3可以直观地看出NIR定量校正模型的预测值与实际测得芍药苷含量之间的相关性。表5结果显示芍药苷含量模型的RMSEP值为0.2006,RSEP (%)小于10%,说明近红外光谱分析方法基本可以较好地预测气滞胃痛颗粒提取液芍药苷的含量。
4. 结论
本研究建立了气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷含量的近红外快速分析方法,所用的气滞胃痛提取液芍药苷含量的数据由苏州泽达兴邦医药科技有限公司实验室测定。通过偏最小二乘法(PLSR)对提取液中芍药苷含量的定量校正模型的建立,得出的最优模型的相关系数R为0.9542,RMSEP为0.697,RSEP (%)为3.45,满足定量分析的要求。所建立的近红外模型能够在较短的时间内通过采集近红外光谱对气滞胃痛颗粒提取液中芍药苷含量进行测定,相较于传统方法(液相、紫外等)具有简便、快速、无损的优点。