二乙基二硫代氨基甲酸钠(DTC)与砷、锑、铋配合物的合成及其对H1299肺癌细胞生物活性的研究

Synthesis of Sodium Diethyldithiocarbamate (DTC) Complexes with Arsenic, Antimony and Bismuth and Its Bioactivity on H1299 Lung Cancer Cells

摘要: 本论文用室温液液反应合成了DTC与砷、锑、铋的生物配合物，其分别对应三种活性药物。测定了配合物的粉末X-射线衍射图谱，并用计算机程序对图谱进行了指标化，确定了配合物所属晶系和晶胞参数；通过元素分析确定了配合物的组成；用1HNMR研究了金属离子和生物配体的配位情况；用差热–热重分析研究了配合物热分解过程及成键行为；并对三种砷的生物配合物进行了H1299肺癌细胞生物活性实验研究，结果表明：合成的配合物比单用配体和碘化砷对肺癌细胞的抑制作用都强。

Abstract: In this paper, the biological complexes of DTC with arsenic, antimony and bismuth were synthesized by liquid-liquid reaction at room temperature, which correspond to three active drugs respectively. The powder X-ray diffraction pattern of the complex was determined, the pattern was indexed by computer program, and the crystal system and cell parameters of the complex were determined; the composition of the complex was determined by elemental analysis; the coordination of metal ions with biological ligands was studied by 1HNMR; the thermal decomposition process and bonding behavior of the complexes were studied by differential thermal gravimetric analysis; the biological activity experiments of H1299 lung cancer cells were carried out for the three biological complexes of arsenic. The results showed that the synthetic complexes had stronger inhibitory effects on lung cancer cells than ligands and arsenic iodide alone.

1. 引言

砷、锑、铋属于第V主族金属元素，由于主族金属离子外层电子轨道不是d轨道，所以其配位能力比过渡金属和稀土金属弱得多，而人们对它们的研究也比较少。但就目前已研究合成的各种砷、锑、铋离子的配合物而言，它们中的大多数都对很多疾病有着显著的疗效。

元素砷是人体的痕量生命元素，小剂量服用能够刺激造血过程，使人体产生大量的红血球白蛋白，同时还能够增强血管的渗透性，促使新陈代谢。急性早幼粒细胞白血病是一种严重威胁着人类健康的血液病，上海血液病研究所研究发现砷剂能够诱导急性早幼粒细胞白血病细胞NB4凋亡 [1]，具有时间剂量依赖性。在低浓度可诱导其分化，高浓度诱导凋亡。又有研究表明As₂O₃与许多药物都具有协同作用，如BaZarachi等报道As₂O₃和IFN-α协同诱导HTLV-l转化的细胞凋亡，提示As₂O₃与药物联合可以治疗其他肿瘤。

很多含锑的化合物可以用做药物，锑的胺羧酸配合物对肿瘤具有显著的疗效，如：二乙三胺五乙酸锑 [2]。葡萄糖酸锑钠是内脏和皮肤疾病的主要治疗药 [3]。谢孝泉 [4] 等发表了关于用葡萄精酸锑不同疗程治疗黑热病复发病的临床病例研究，收到了满意的效果。

铋是元素周期表中最重的稳定金属元素。铋的化合物在医学上的应用已超过200年，但其生物化学并没有深入系统的研究，直到近年来才逐渐引起重视。铋在人体中的吸收极低，大部分是由肾脏经尿液排出。由于铋类药物不溶于水，其药物粒度越小，水溶性越大、疗效就越好 [5] [6]。所以，当前将铋类药物向细微化水溶性方向发展。在当今癌症严重威胁人类生命之时，对开发铋类药物有极其重要的意义。这里主要合成了DTC与砷、锑、铋的生物配合物，并对三种砷的生物配合物进行了H1299肺癌细胞生物活性实验 [7] 研究。

2. DTC三氯化锑配合物

2.1. 配合物的合成

称取0.8599 g (3.77 mmol) SbCl₃与2.7520 g (11.30 mmol) DTC(分子式C₅H₁₀NS₂Na∙3H₂O，式量：225.31)，分别溶于甲醇，将DTC的甲醇溶液滴加至SbCl₃的甲醇溶液中，室温(30℃)搅拌反应数分钟后，反应溶液中有浅黄色沉淀析出，继续搅拌反应4 h，停止反应，加入10 mL乙醚萃取，搅拌2 min后，抽滤，沉淀用无水乙醚洗涤2次，然后用去离子水洗涤产物至无Cl⁻ (用AgNO₃检查)，60℃的真空干燥箱中干燥3 h，得浅黄色粉末2.14 g，产率87%。产物在空气中稳定，不吸潮，可溶于氯仿。

可能的反应方程式如下：

2.2. 配合物结构的表征

2.2.1. 粉末X-射线衍射

为了检验产物是否为单一物相化合物，对合成的SbCl₃-DTC配合物做了粉末X-射线衍射分析，其谱图见图1。

Figure 1. Powder X-ray diffraction pattern of SbCl₃-DTC complex

图1. SbCl₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射图谱

用计算机程序对SbCl₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射谱图进行指标化计算，其计算结果列在表1中。

Table 1. X-ray diffraction data and calculation results of SbCl3-DTC complex

表1. SbCl₃-DTC配合物X-射线衍射数据和计算结果。

从上述计算结果可以发现：所有衍射峰都能很好地按照单斜晶系的一套晶格参数来进行指标化计算。而且，计算的晶面间距D和实验测量的晶面间距D0相当接近，最大相对百分误差也小于0.5%，这表明产物的物相是单一的，其晶体结构属于单斜晶系。

2.2.2. 元素分析

从反应的物料比和反应现象推测，金属锑原子很可能是与六个硫原子形成六配位的分子结构，产物可能的分子式为：Sb(C₅H₁₀NS₂)₃，通过元素分析对此分子式的验证如表2所示。

Table 2. Percentage molecular formula Sb(C5H10NS2)3 of each element in the reaction product of SbCl3 and DTC

表2. SbCl₃与DTC反应产物中各元素的百分含量分子式Sb(C₅H₁₀NS₂)₃

2.2.3. 差热–热重分析

众所周知，差热–热重分析可以对配合物的组成配位情况进一步说明，通过对差热–热重谱图的解析，该配合物可能的热分解过程如表3所示：

Table 3. Possible thermal decomposition processes of complexes

表3. 配合物可能的热分解过程

2.2.4. 溶解性和¹HNMR谱

由差热–热重分析的结果也从另一个侧面反映了所推测分子式的正确性。对配合物溶解性试验表明此配合物可溶于三氯甲烷、二甲基亚砜。用氘代三氯甲烷为溶剂对配合物又做了¹HNMR谱，如图2所示：化学位移值在7.3的单峰为氘代三氯甲烷的溶剂峰，化学位移值在3.8的四重峰为配合物分子中-CH₃基团上相同化学环境的3个H裂分所引起的；化学位移值在1.3的三重峰为配合物分子中-CH₂基团上相同化学环境的2个H裂分所引起的。化学位移值在1.5附近的单峰可能是由于反应溶剂甲醇未洗干净代入的杂质峰。

Figure 2. ¹HNMR spectra of SbCl₃-DTC complex

图2. SbCl₃-DTC配合物的¹HNMR图谱

2.3. 小结

用液液反应方法所得到的SbCl₃与DTC的配合物由各种分析测试结果表明所推断的可能分子式是正确的，虽然XRD的结果对配合物的晶系做了归属，但详细的配位情况还有待于做单晶测试进一步说明。

3. DTC三氯化铋配合物

3.1. 配合物的合成

准确称取1.5184 g (4.82 mmol) BiCl₃与3.2547 g DTC，分别溶于甲醇，将DTC的甲醇溶液逐滴加至BiCl₃的甲醇溶液中，室温(30℃)搅拌反应数分钟后反应溶液中有黄色沉淀析出，继续搅拌反应4 h，加入10 mL乙醚萃取剂，搅拌2 min后，抽滤，沉淀用无水乙醚洗涤2次，然后用去离子水洗涤产物至无Cl⁻ (用AgNO₃检查)，60℃的真空干燥箱中干燥3 h，得黄色结晶粉末2.95 g。产物在空气中稳定，不吸潮，可溶于氯仿。

3.2. 配合物结构的表征

3.2.1. 粉末X-射线衍射分析

为了检验产物是否为单一物相化合物，对合成的BiCl₃-DTC配合物做了粉末X-射线衍射分析，其谱图见图3。

Figure 3. Powder X-ray diffraction pattern of BiCl₃-DTC complex

图3. BiCl₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射图谱

用计算机程序对BiCl₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射图谱进行指标化计算，其计算结果列在表4。

从上述计算结果可以发现：所有衍射峰都能很好地按照单斜晶系的一套晶格参数来进行指标化计算。而且，计算的晶面间距D和实验测量的晶面间距D0相当接近，最大相对百分误差也小于0.5%，这表明产物的物相是单一的，其晶体结构属于单斜晶系。

Table 4. X-ray diffraction calculation of BiCl3-DTC complex

表4. BiCl₃-DTC配合物X-射线衍射计算结果。

3.2.2. 元素分析

金属铋原子很可能也是与六个硫原子形成六配位的类似于SbCl₃与DTC反应产物的分子结构，通过元素分析的结果也证明了这一类似结构，BiCl₃与DTC反应产物的元素分析结果如表5所示：

Table 5. Percentage molecular formula Bi(C5H10NS2)3 of each element in the reaction product of BiCl3 and DTC

表5. BiCl₃与DTC反应产物中各元素的百分含量分子式Bi(C₅H₁₀NS₂)₃

3.2.3. 差热–热重分析

用与SbCl₃-DTC配合物相同的方法对BiCl₃与DTC反应产物也做了差热–热重分析如表6所示：

Table 6. Possible thermal decomposition processes of complexes between BiCl3 and DTC

表6. BiCl₃与DTC反应产物可能的热分解过程

通过对BiCl₃与DTC反应产物所做的元素分析与差热–热重可能的热分解过程的分析进一步证明了BiCl₃与DTC反应的产物分子式可能为Bi(C₅H₁₀NS₂)₃。

Figure 4. ¹HNMR spectra of BiCl₃-DTC complex

图4. BiCl₃-DTC配合物的¹HNMR图谱

3.2.4. 溶解性和¹HNMR谱

对配合物溶解性试验表明：BiCl₃-DTC配合物可溶于三氯甲烷、二甲基亚砜，用氘代三氯甲烷为溶剂对配合物又做了¹HNMR谱，如图4所示：化学位移值在7.3的单峰为氘代三氯甲烷的溶剂峰，化学位移值在3.8的四重峰为配合物分子中-CH₃基团上相同化学环境的3个H裂分所引起的；化学位移值在1.3的三重峰为配合物分子中-CH₂基团上相同化学环境的2个H裂分所引起的。化学位移值在1.5附近的单峰可能是由于反应溶剂甲醇未洗干净代入的杂质峰，这个峰与SbCl₃-DTC配合物中的一样，也说明了此推断的正确性。

4. DTC碘化砷配合物

4.1. 配合物的合成

称取0.8911 g (1.96 mmol) AsI₃与1.3219 g DTC，分别溶于甲醇，将DTC的甲醇溶液慢慢滴加至AsI₃的甲醇溶液中，室温搅拌反应数分钟后，从澄清的溶液中析出浅黄色沉淀，继续搅拌反应4 h，加入10 mL乙醚萃取，搅拌2 min后，抽滤，用无水乙醚洗涤沉淀2次，60℃的真空干燥箱中干燥3 h，得黄色粉末。产物在空气中稳定，不吸潮，可溶于氯仿。

4.2. 配合物结构的表征

粉末X-射线衍射分析

为了检验产物是否为单一物相化合物，对合成的AsI₃-DTC配合物做了粉末X-射线衍射分析，其谱图见图5。

Figure 5. Powder X-ray diffraction pattern of AsI₃-DTC complex

图5. AsI₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射图谱

用计算机程序对AsI₃-DTC配合物的粉末X-射线衍射图谱进行指标化计算，其计算结果列在表7。

Table 7. X-ray diffraction calculation of AsI3-DTC complex

表7. AsI₃-DTC配合物X-射线衍射计算结果。

从上述计算结果可以发现：所有衍射峰都能很好地按照单斜晶系的一套晶格参数来进行指标化计算。而且，计算的晶面间距D和实验测量的晶面间距D₀相当接近，最大相对百分误差也小于0.5%，这表明产物的物相是单一的，其晶体结构属于单斜晶系。

由于砷是对人体有害的元素，对DTC与碘化砷形成的配合物没有做更进一步的分析，另外，AsI₃-DTC配合物的溶解性较差，因此也未做¹HNMR图。

5. 配合物的生物活性实验(对H1299肺癌细胞抑制率的测定)

5.1. 实验原理

测定AsI₃-DTC配合物对癌细胞的抑制率，可供选择药物时参考。方法为MTT法。其原理是MTT (四甲基唑蓝)为一种染色剂，可被活细胞染色，形成不溶于水的蓝紫色结晶物质，这种晶体的生成量与活细胞的数目、细胞种类、作用时间等有关。当细胞种类和作用时间一定时，则晶体的生成量就与细胞的数量成直线关系。而该晶体又可以溶于DMSO等有机溶剂，这样就可以通过酶标仪用490 nm~570 nm的光来测定其吸光值，依次确定其晶体生成量，从而测知活细胞的数量。

5.2. 实验方法

1) 用扭力天平分别称取DTC、AsI₃和DTC-AsI₃配合物0.2 mmol，用DMSO做溶剂溶解，并在震荡器上震荡促使其溶解完全，然后在无菌室中用生理盐水将三种物质的浓度分别稀释至80 μmol/L，40 μmol/L，20 μmol/L，10 μmol/L，5 μmol/L，2.5 μmol/L，1.25 μmol/L的溶液。

2) 将H1299细胞悬浮液接种于96孔培养液中，每孔100 μL，然后在实验组加入上述不同浓度的药物稀释液100 μL，对照组不加药，另设空白组(只有培养液，无细胞)，每组4个复孔。在37℃的CO₂培养箱中培养72小时，然后加入5 μg/mL的MTT 20 μL，继续在CO₂培养箱中放置4小时，拿出后可观察到孔中的液体呈现不同程度的紫色，在离心机上离心20分钟，使染色的细胞贴于试剂盒底部的壁上，倒掉上层清夜，在每孔加入DMSO溶剂200 μL，然后在摇床上摇动1小时，放入酶标仪上检测530 nm处的吸光值(A₅₃₀)。

3) 结果 抑制率的计算公式

$抑制率\left(\%\right)=\left({\text{A}}_{对照}-{\text{A}}_{实验}\right)/{\text{A}}_{对照}\times \text{1}00\%$

将DTC、AsI₃、DTC-AsI₃分别对H1299细胞所测定的吸光值的对照表列于表8中。

Table 8. Comparison of absorbance values of three substances on H1299 cells

表8. 三种物质对H1299细胞的吸光值比较

将DTC、AsI₃、DTC-AsI₃三种物质按照抑制率计算公式求出抑制率，然后由浓度和抑制率分别作为横纵坐标做出曲线图，如图6所示：

Figure 6. Comparison of inhibition rates of three drugs on H1299 cells

图6. 三种药物对H1299细胞的抑制率比较

5.3. 结论

从图中可以看出，当抑制率同为50%时，对应的三种物质的浓度，DTC-AsI₃配合物的浓度最低，这个试验初步说明了DTC-AsI₃配合物具有比单独利用碘化砷和DTC更好的药效。

6. 结论

总之，用室温液液反应成功合成了DTC与砷、锑、铋的生物配合物，通过配合物的粉末X-射线衍射图谱，利用计算机程序对图谱的指标化，计算的晶面间距D和实验测量的晶面间距D0相当接近，最大相对百分误差小于0.5%，可知产物的物相是单一的，其晶体结构属于单斜晶系。通过元素分析对分子式进行了验证。用差热–热重分析研究了配合物热分解过程及成键行为，从另一个侧面反映了所推测分子式的正确性。用¹HNMR研究了金属离子和生物配体的配位情况。最后，对三种砷的生物配合物进行了H1299肺癌细胞生物活性实验研究，表明合成的配合物比单用配体和碘化砷对肺癌细胞的抑制作用都强。

NOTES

^*通讯作者。