壳聚糖–海藻酸钠–丹参酮IIA微球的制备及其工艺优化

Preparation and Process Optimization of Chitosan-Sodium Alginate-Tanshinone IIA Microspheres

摘要: 目的：优化壳聚糖–海藻酸钠(CS-SA)包裹丹参酮IIA (TIIA)的工艺条件，得到最佳工艺。方法：研究海藻酸钠含量、壳聚糖含量、Ca²⁺含量、Span-80等工艺条件对微球粒径分布的影响，在此基础上，研究SA、CS、Ca²⁺含量对载药量的影响，以工艺参数进行优化。结果：最佳工艺条件：SA含量为1.5%、Ca²⁺含量30%、CS含量0.4%，在该最佳工艺条件下，最大载药量达到13.2%。结论：为CS-SA包裹TIIA工业化生产应用提供了方向。

Abstract: Objective: The research aimed to optimize the process conditions of tanshinone IIA (TIIA) encapsulated by chitosan-sodium alginate (CS-SA) and obtain the best process. Method: The effects of sodium alginate content, chitosan content, Ca²⁺ content, Span-80 and other process conditions on the particle size distribution of microspheres were studied. On this basis, the effects of SA, CS and Ca²⁺ content on drug loading were studied. The process parameters were optimized. Result: The optimal process conditions: SA content was 1.5%, Ca²⁺ content was 30%, CS content was 0.4%. Under the optimal process conditions, the maximum drug loading amount reached 13.2%. Conclusion: It provides a direction for the industrial production and application of CS-SA wrapped TIIA.

1. 引言

壳聚糖(CS)是可进行离子交联的聚合物类别中最通用的生物聚合物 [1]。由于其通过碱性脱乙酰作用从几丁质(自然界中最丰富的多糖)中衍生而来，因此含量丰富，且成本低廉且对环境友好。此外，壳聚糖存在胺基结构，使其在略低的pH值下具有良好的水溶性；氢键容易在分子内和分子间形成；由于存在不同的官能团(-OH、-NH₂、-C-O-C)，从而容易对其进行化学改性，因此具有出色的成膜能力。海藻酸钠(SA)是从褐藻中提取的一种线性阴离子多糖，由-1,4-D-麦芽糖酸(M)-1,4-L-古洛糖醛酸(G)和-1,4-L-古洛糖醛酸(G)单元交替排列而成，根据将M和G的排列组合，可以提供各种等级的SA [2] [3]。丹参酮IIA (Tanshinone IIA, TIIA)为丹参中的主要脂溶性有效成分，具有预防和治疗心血管疾病，脑血管疾病、改善微循环、和癌症等方面的多重药理作用 [4] [5] [6] [7] [8]。但是，TIIA的水溶性差(2.8 ng/mL)、半衰期短(1~2小时) [9]，导致口服生物利用度低。因此，研究对TIIA进行包裹并且充分利用TIIA有着十分重要的意义。为此，我们优化了CS-SA包裹TIIA的最佳工艺条件，为TIIA工业化生产应用提供了方向。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 研究对象

丹参酮IIA (TIIA)购买自阿拉丁试剂有限公司，纯度为98%。

2.1.2. 试剂

海藻酸钠，化学纯，青岛海伽生物科技有限公司；壳聚糖，化学纯，山东奥康生物科技有限公司；碳酸钙、液体石蜡、乙酸、Span-80、皆为分析纯，来自成都金山化学试剂有限公司。

2.1.3. 主要仪器

752型紫外分光光度计；Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪；飞纳Prox型扫描电镜；TG-20离心机；Lab-1 A50型冷冻干燥机。

2.2. 方法

2.2.1. CS-SA微球的制备方法

称取一定量海藻酸钠分散在100 mL蒸馏水中充分溶解后，按照设定比例添加适量碳酸钙，超声5 min作为水相。在液体石蜡中加入适量乳化剂Span-80，搅拌混合均匀后作为油相。称取特定量壳聚糖分散在100 mL 0.5%的醋酸溶液中，完全溶解后作为交联相。将上述水相缓慢滴加到油相中，机械搅拌乳化30 min。然后加入醋酸与碳酸钙反应2 h，使碳酸钙完全溶解。接着将所得乳液滴加至壳聚糖交联相中，滴加完毕后交联反应30 min。离心过滤，蒸馏水洗涤，冷冻干燥12 h，得到微球备用。

2.2.2. 单因素试验

1) SA含量的选择。固定Ca²⁺含量40%、Span-80含量1%、CS含量为0.4%作为不变因素，设定SA的含量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，研究SA含量对CS-SA的粒径分布好的影响。

2) Ca²⁺含量的选择。固定SA含量为1.5%、Span-80含量1%、CS含量为0.4%作为不变因素，设定Ca²⁺的含量为10%、20%、30%、40%和50%，研究Ca²⁺含量对CS-SA的粒径分布的影响。

3) CS含量的选择。固定SA含量为1.5%、Ca²⁺含量40%作为不变因素，设定CS的含量为0.2%、0.4%、0.8%和1.6%，研究CS含量对CS-SA的粒径分布的影响。

2.2.3. 丹参酮IIA标准曲线的测定方法

精密称取一定量的丹参酮IIA，将其分别溶于乙醇中配制成浓度分别为(3，4，5，6，7，8) mg/mL的溶液，用紫外分光光度计(752型)在270 nm处测定吸光度值(A)，求得回归标准曲线方程：“y = 0.0757x + 0.0716”，R² = 0.9992。

2.2.4. 载药率测定

称取15 mg载药微球加入到柠檬酸三钠(0.06 mol/L)和碳酸氢钠(0.2 mol/L)中，超声使丹参酮IIA从微球中完全释放，后转移至容量瓶中定溶至200 mL。在270 nm处紫外分光光度下测定所释放药物吸光度，根据方程计算出浓度，再计算出载药率。载药率(LC)用公式(1)计算：

$\text{LC}\left(\%\right)=\left[\left(\text{Ma}-\text{Mb}\right)\right]/\text{Mc}\times 100\%$ (1)

其中，Ma——初始丹参酮IIA重量；Mb——损失丹参酮IIA重量；Mc——干燥后载药微球重量。

3. 结果与分析

3.1. 各因素对粒径分布影响的结果分析

3.1.1. SA含量对粒径分布的影响

由图1可知，SA的含量对微球的粒径分布有显著影响，含量分别在0.5%和1%时，微球的粒径分布的大小均显著低于其含量为1.5%与2.0%、2.5%的水平。这是因为SA含量越多，与Ca²⁺交联形成的水凝胶网络越牢固致密，但是交联固化程度越高，粒径分布也随之增加。SA浓度为1.5%、2.0%时的粒径分布与其浓度为25%时的差异不显著，说明SA与Ca²⁺的交联度达到最大，继续增加海藻酸钠含量并未增大粒径分布，反而会浪费材料。因此最终选用海藻酸钠含量为1.5%作为该复合物的最佳水平。

3.1.2. Ca²⁺含量对粒径分布的影响

由图2可知，由CS-SA形成的聚合电解质物质并不牢固，因此需要加入交联剂固化。本试验结果表明Ca²⁺含量对微球粒径分布影响显著。Ca²⁺含量为10%、20%时粒径分布不均匀，但当其浓度为50%时粒径分布跨度小且均匀。造成差异的原因可能是当Ca²⁺浓度为10%、20%时，交联固化不充分，其粒径分布跨度远高于其他水平。因此筛选Ca²⁺含量40%为最佳条件。

3.1.3. CS含量对粒径分布的影响

由图3可知，随着CS浓度的增加，微球的粒径分布均也呈现增加的趋势，表明CS用量适宜时，可以增大凝胶状物质的致密度，但随着CS含量的增加，反应体系的黏度也会明显增大，黏度过高会阻碍CS与SA反应的充分性。因此最后选取CS的含量为0.4%。

Figure 1. Effect of SA content on particle size distribution of CS-SA microspheres

图1. SA含量对CS-SA微球的粒径分布影响

Figure 2. Effect of Ca²⁺ content on particle size distribution of CS-SA microspheres

图2. Ca²⁺含量对CS-SA微球的粒径分布影响

Figure 3. Effect of CS content on particle size distribution of CS-SA microspheres

图3. CS含量对CS-SA微球的粒径分布影响

3.2. 丹参酮IIA (TIIA)标准曲线的绘制

图4是丹参酮IIA的标准曲线。如图所示，其线性回归方程为：“y = 0.0757x + 0.0716”，方程相关系数R² = 0.9992。表明在3~8 mg/mL浓度范围内，丹参酮IIA紫外吸光度A与其浓度C具有良好的线性关系。

Figure 4. Tanshinone IIA standard curve

图4. 丹参酮IIA标准曲线

3.3. 各因素对载药量影响的结果分析

3.3.1. SA含量对载药量的影响

由图5分析可知，随着SA含量的变化，TIIA载药率在8.2%~12.6%之间波动，证明TIIA成功包裹到CS-SA微球中。SA具有相对较大分子量，含量增加后，基体的结构更为致密，使药物分子装载在微球的量更多，另外增加SA含量意味着交联剂Ca²⁺与SA的比例降低，在凝胶生成过程中，其中一部分微球的交联程度增大，出现强度收缩，形成更紧密的结构，从而延长了药物释放路径，避免了药物大量流失。但是SA含量在2.5%时，由于黏度过大，在制备过程中可能导致药物损失，造成浪费。

Figure 5. Effect of SA content on drug loading of CS-SA microspheres

图5. SA含量对CS-SA微球的载药量影响

3.3.2. CS含量对载药量的影响

从图6中可以看出，CS对载药率的影响也很大，随着CS含量从0%增加到0.8%后，药物负载效率从8.1%增加到12.5%，这表明CS中- $N{H}_3^{+}$ 基团与SA中-COO⁻基团形成复合凝胶结构，仿佛给药物加盖一层外衣，起到更好的保护作用。即CS浓度越高，载药微球的外壳越厚，使得药物在制备过程中会损失掉更少。但是当CS浓度增到1.6%的时候，载药率有所下降，这是因为随着壳聚糖浓度的增加，交联相的黏度也会显著增加，黏度过高会阻碍交联反应充分进行。

Figure 6. Effect of CS content on drug loading of CS-SA microspheres

图6. CS含量对CS-SA微球的载药量影响

3.3.3. Ca²⁺含量对载药量的影响

从图7可知，随着Ca²⁺含量从10%增加到30%，LC从9.8%增加到13%，这种行为可能由于CS-SA微球拥有更紧密、更平滑的表面，减少了TIIA分子从CS-SA微球内核中转移出。当Ca²⁺浓度从30%增加到50%，LC从13.2%减少到4%，这是因为Ca²⁺与SA的缔结太过致密，微球的核减小，微球的内部表面积减小，TIIA装载的量也随之减小。

Figure 7. Effect of Ca²⁺content on drug loading of CS-SA microspheres

图7. Ca²⁺含量对CS-SA微球的载药量影响

4. 结论与讨论

壳聚糖–海藻酸钠微球具有无毒副作用、生物相容性高、生物可降解性和抗病毒等特点，因此本文以其作为药物递送系统包裹丹参酮IIA。采用乳化凝胶法壳制备壳聚糖–海藻酸钠(CS-SA)微球，研究海藻酸钠含量、Ca²⁺含量、壳聚糖含量等工艺条件对微球粒径分布的影响；以丹参酮IIA (TIIA)为生物大分子药物，研究对CS-SA/TIIA复合物的制备工艺进行优化。最佳工艺条件：SA含量为1.5%、Ca²⁺含量30%、CS含量0.4%，在该最佳工艺条件下，最大载药量达到13.2%。为CS-SA包裹TIIA工业化生产应用提供了方向。

致谢

首先，我要感谢我的导师，没有史浩老师的悉心的指导帮助，我不可能顺利完成实验和论文。其次，我要感谢李枭、李千金、董祖琴、张腾等我师弟师妹们，感谢他们在实验中给予的帮助和意见。最后对大学生创新创业计划的基金项目表达诚挚的谢意。

基金项目

大学生创新创业计划(201810616053)。