COPD患者诱导痰中IL-6、IL-8水平与炎症表型的相关性研究

Study on the Correlation between IL-6 and IL-8 Levels in Induced Sputum of COPD Patients and Inflammatory Phenotypes

摘要: 目的：探讨慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者诱导痰中白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白介素-8 (interleukin-8, IL-8)与炎症表型的相关性，为COPD患者精准治疗提供理论依据及监测指标。方法：选取2019年12月至2020年12月山西医科大学附属汾阳医院30例慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)和30例慢性阻塞性肺疾病稳定期患者(Stable stage of chronic obstructive pulmo-nary disease, SCOPD)，所选患者均行肺功能、诱导痰检查，分析诱导痰中IL-6、IL-8水平与COPD患者GOLD分级(又称肺功能分级)及炎症表型的关系。结果：AECOPD患者诱导痰中IL-6、IL-8水平明显高于SCOPD患者(P < 0.05)，与GOLD分级呈正相关(P < 0.05)，在不同炎症表型中有差异(P < 0.05)，非嗜酸性粒细胞表型 > 嗜酸性粒细胞表型。结论：COPD患者诱导痰中IL-6、IL-8水平与慢阻肺患者急性加重相关，与GOLD分级呈正相关，在嗜酸性粒细胞表型中较非嗜酸性粒细胞表型中表达低。

Abstract: Objective: To explore the correlation between induced sputum interleukin-6 (IL-6) and interleu-kin-8 (IL-8) and inflammatory phenotypes in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), so as to provide theoretical basis and monitoring indicators for precision therapy of COPD patients. Methods: To choose between December 2019 and December 2020 in Fenyang Hospital Af-filiated to Shanxi Medical University 30 cases of acute exacerbation of chronic obstructive pulmo-nary disease (AECOPD) and 30 cases of patients with stable stage of chronic obstructive pulmonary disease (SCOPD), lung function and induced sputum examinations were performed in all selected patients to analyze the relationship between IL-6 and IL-8 levels of induced sputum and GOLD grading (pulmonary function classification) and inflammatory phenotypes in COPD patients. Results: The IL-6 and IL-8 levels in the induced sputum of patients with AECOPD were significantly higher than those of patients with SCOPD (P < 0.05), which were positive correlation with the GOLD grading (P < 0.05), and there are differences among different inflammatory phenotypes (P < 0.05): Non eo-sinophilic phenotype > eosinophilic phenotype. Conclusion: Levels of IL-6 and IL-8 in induced spu-tum of COPD patients correlated with acute exacerbations in COPD patients, positively correlated with gold grade, and have lower expression in the eosinophilic phenotype than in the non eosino-philic phenotype.

1. 引言

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺，COPD)是一种常见的、可预防、可治疗的以持续的呼吸道症状和气流受限为特征，通常是由于大量暴露于有毒颗粒或有毒气体所致的气道和/或肺泡异常引起，最常见的症状是呼吸困难、咳嗽和/或咳痰 [1]。慢阻肺急性加重是导致患者气道症状加重，炎症细胞和炎症因子水平的变化参与急性加重的过程。COPD患者存在异质性 [2]，且目前有研究 [3] 根据COPD患者诱导痰中细胞的比例将COPD炎症表型分为：嗜酸性粒细胞型(Eosinophil phenotype, EO)、中性粒细胞型(Neutrophil phenotype, NE)、混合粒细胞型(Mixed granulocyte phenotype, MC)、少粒细胞型(paucigranulocytic asthma, PA)，不同炎症表型治疗反应、病情程度及预后均不同。其中嗜酸性粒细胞表型与病情恶化的风险增加有关，嗜酸性粒细胞计数升高可预测COPD患者对吸入性糖皮质激素(inhaled corticosteroids, ICS)的反应，这可能会影响死亡率 [4] [5]。细胞因子与亚型、COPD严重程度、疾病进展有极大的相关性 [6]，其中IL-6、IL-8在COPD的发生发展中有着重要的作用。诱导痰检查被认为是一种有效、安全、相对无创的方法，可以用来描述包括COPD在内的多种气道疾病的气道炎症 [7]。本研究旨在通过探讨IL-6、IL-8水平在COPD患者急性加重期及稳定期诱导痰中的差异，及其在COPD患者不同炎症表型中的差异，进而为COPD患者精准治疗提供更多的预测指标。

2. 对象与方法

2.1. 研究对象

选取2019年12月至2020年12月山西医科大学附属汾阳医院收治的AECOPD患者和SCOPD患者各30例。诊断标准参照2020年GOLD指南：吸入支气管扩张剂后FEV1/FVC (Forced expiratory volume In 1s/Forced vital capacity，第1秒用力呼气容积/用力呼气容积) < 70%，同时排除其他已知病因或具有特征病理表现的气流受限疾病，即可诊断为慢性阻塞性肺疾病。AECOPD诊断标准：呼吸道症状急剧恶化，需要额外的治疗。本研究经过医院伦理委员会审查批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2.1.1. 纳入标准

1) 50岁 ≤ 年龄 ≤ 80岁；2) 所选患者均符合中华医学会呼吸病学分会慢阻肺的诊断标准。

2.1.2. 排除标准

1) 近2周有激素、免疫抑制剂、抗菌药物使用史；2) 近期有外伤手术史；3) 合并其他慢性呼吸系统疾病；4) 合并呼吸系统之外的疾病：如肿瘤、结缔组织病、糖尿病、甲状腺功能亢进、高血压病、严重心力衰竭(心功能III、IV级)等严重疾病者。

2.2. 研究方法

2.2.1. 患者一般资料

收集所有研究对象的一般资料：包括年龄、性别、身高、体重、体质指数(Body Mass Index, BMI) =体重/身高² (kg/m²)、吸烟史。

2.2.2. 肺功能测定

所入选对象均按标准规范的操作流程完成肺功能检查，并参照指南和标准进行COPD GOLD分级：I级(轻度气流受限)：FEV1%pred (第1秒用力呼气容积占预计值百分比) ≥ 80%；II级(中度气流受限)：50% ≤ FEV1%pred < 80%；III级(重度气流受限)：30% ≤ FEV1%pred < 50%；IV级(极重度气流受限)：FEV1%pred < 30%。

2.2.3. 诱导痰液的采集

采用超声雾化吸入高渗盐水诱导痰液的产生。嘱患者吸入短效b2受体激动剂如沙丁胺醇400 ug，10分钟后用清水漱口并排鼻涕；以浓度为3%的高渗盐水为入选患者进行雾化15 min后漱口，吐净唾液后再咳出痰液至医用痰杯中。若无痰或痰量不足(<0.5 g)则依次以3%，4%，5%的高渗盐水雾化7 min，直至诱导产生痰液。在诱导期间密切监测受试者在诱导期间的不良反应以便及时停止检查，若雾化时间超过30分钟可停止诱导以防患者出现不适。标本2 h内送，不能及时送检的标本置于4℃保存且在24 h内处理。

2.2.4. 痰液处理

取无唾液成分的痰液放入离心试管中，加4倍体积的0.1%二硫苏糖醇(DTT)，螺旋振荡15 min，再置于37℃恒温水浴振荡箱振荡15 min，3500 r/min离心10 min。使用300目尼龙滤网过滤，将滤液置于3000 r/min离心10 min。痰液沉渣作细胞学检测，沉渣混匀涂片，风干后用10%甲醛固定15 min，流水冲洗后行瑞氏–吉姆萨染色，烤箱烤干玻片并树脂封片后于光镜下对细胞分类计数，鳞状上皮细胞 < 20%为合格标本。上清液于−80℃冻存待测。

2.2.5. 炎症细胞计数

取合格诱导痰标本行HE染色，以嗜酸性粒细胞计数 ≥ 3%为界分为嗜酸性粒细胞组(Eos)和非嗜酸性粒细胞组(Noneos)。

2.2.6. 细胞因子检测

采用酶联免疫吸附法ELISA法检测诱导痰上清液中IL-6、IL-8的水平，严格按照试剂盒(上海广锐生物科技有限公司)说明书进行。

2.2.7. 统计学处理

采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用t检验，实验结果以均数 ± 标准差( $\bar{x}\pm s$)表示；计数资料采用χ²检验。检验值均以P < 0.05为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 一般资料比较

比较实验组和对照组中研究对象一般资料，发现两组在性别、年龄、吸烟史、体质指数之间差异无统计学意义。见表1。

Table 1. Comparison of general data between AECOPD group and SCOPD group

表1. AECOPD组和SCOPD组一般资料的比较

注：P < 0.05差异有统计学意义。

3.2. AECOPD组和SCOPD组诱导痰中IL-6、IL-8水平的比较

慢阻肺急性加重期和稳定期患者诱导痰中IL-6水平均值分别为244.40 pg/ml、122.10 pg/ml，这表明COPD患者诱导痰中IL-6与急性加重相关；AECOPD和SCOPD组中IL-8水平均值分别为167.92 pg/ml、119.80 pg/ml，说明IL-8参与COPD患者急性加重事件的发生。见表2。

Table 2. Comparison of IL-6 and IL-8 in induced sputum between the two groups ( $\bar{x}\pm s$ )

表2. 两组患者诱导痰中IL-6、IL-8比较( $\bar{x}\pm s$)

注：P < 0.05差异有统计学意义。

3.3. 不同COPD GOLD分级患者中IL-6、IL-8水平的比较

对慢阻肺稳定期患者进行GOLD分级，GOLD I级11例，GOLD II级9例，GOLD III级5例，GOLD IV级5例。通过单因素方差分析结果显示：肺功能分级越高，其诱导痰中IL-6、IL-8水平越高。这表明慢阻肺患者诱导痰中IL-6、IL-8水平与GOLD分级呈正相关。见表3。

Table 3. Levels of IL-6 and IL-8 in induced sputum of COPD patients with different GOLD grades ( $\bar{x}\pm s$ )

表3. COPD患者不同GOLD分级诱导痰中IL-6、IL-8水平( $\bar{x}\pm s$)

注：COPD患者诱导痰中IL-6水平比较：与GOLD I级对比，^aP < 0.05；与GOLD II级对比，^bP < 0.05；与GOLD III级对比，^cP < 0.05。COPD患者诱导痰中IL-8水平比较：与GOLD I级对比，^aP < 0.05；与GOLD II级对比，^bP < 0.05；与GOLD III级对比，^cP < 0.05。

3.4. 不同表型中IL-6、IL-8水平的比较

嗜酸性粒细胞型有27例(45%)，非嗜酸性粒细胞型有33例(55%)，且在慢阻肺患者嗜酸性粒细胞组患者诱导痰中IL-6、IL-8水平均值分别为128.21 pg/ml、111.14 pg/ml，非嗜酸性粒细胞组IL-6、IL-8水平均值分别为228.28 pg/ml、170.63 pg/ml。表明IL-6、IL-8水平在非嗜酸性粒细胞型(Noneos) COPD患者诱导痰中高于嗜酸性粒细胞型(Eos) COPD。见表4。

Table 4. Distribution of IL-6 and IL-8 in the induced sputum of COPD patients with different inflammatory phenotypes ( $\bar{x}\pm s$ )

表4. COPD患者诱导痰中IL-6、IL-8在不同炎症表型的分布( $\bar{x}\pm s$)

注：P <0.05差异有统计学意义。

4. 讨论

慢性阻塞性肺疾病是一种慢性呼吸系统疾病，目前是世界第四大死亡原因，到2025年至2030年，慢性阻塞性肺病将成为全球第三大死因 [8]。COPD是一种具有多种表型和内型的高度异质性疾病 [9]。慢阻肺急性加重(AECOPD)是指患者呼吸道症状出现超出日常的变异导致额外的治疗 [8]，加速肺功能的恶化，增加患者的经济负担，降低患者生活质量。GOLD分级反映COPD患者气流受限严重程度。表型一词被定义为描述慢性阻塞性肺病个体间的差异，还描述了基因型与环境相互作用所产生的物理外观或生化特性，清楚地确定了对预后有重大影响的亚组 [10]。

痰液诱导(Sputum induction, SI)是无创性研究气道炎症的金标准方法 [11]。诱导痰的来源与自发排痰、支气管肺泡灌洗液、支气管活检的部位不同，主要来源于外周气道至中央气道的分泌物，反映了气道分泌物自然状态下的浓度，具有更集中的细胞和生化物质成分，尤其适合气道炎症疾病的研究 [12] [13]。诱导痰技术作为一种经济、无创、快速、可靠的检查方法，具有很高的安全性和耐受性 [14] [15]，且与常规的支气管肺活检、支气管肺泡灌洗液技术的检测结果具有一致性 [16]。

IL-6是一种由多种基质细胞和免疫细胞中产生的26 kDa、184个氨基酸的多功能糖蛋白和促炎细胞因子，与肺和肺外炎症性疾病相关，与中性粒细胞密切相关，可能驱动炎症表型，从而促进进行性气流限制 [17]。IL-8是一种前炎症介质，主要产生于中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞中，属于中性粒细胞趋化因子，可趋化、激活中性粒细胞，使中性粒细胞中的游离钙离子浓度急剧增高，导致细胞发生变形，释放各种蛋白酶，生成氧自由基，导致气道上皮细胞损伤、脱落，进而导致气道内炎症反应 [18]。

本研究发现COPD患者诱导痰中IL-6水平在AECOPD中明显高于SCOPD，且与GOLD分级呈正相关，差异有统计学意义。这与Aslani MR等人 [19] 在血清学方面的研究一致。这说明此细胞因子与慢阻肺急性加重及气流阻塞程度有关，与COPD患者的预后、并发症、死亡风险相关。且有研究发现IL-6在COPD患者痰液中的水平较血清中明显升高 [20] [21]。本研究发现诱导痰中IL-6水平与GOLD分级呈正相关，这与既往研究 [22] 发现的诱导痰中IL-6值与COPD患者FEV1、FEV1/FVC和病程之间存在显著的负相关本质上是一致的。

IL-8作为一种中性粒细胞趋化因子，通过启动和放大炎症反应参与炎症反应过程 [23]，已被证明是COPD急性加重和进展的原因之一 [24]。高水平的IL-8可导致过度的炎症和组织损伤 [25]。IL-8可反映慢性阻塞性肺疾病的气道炎症程度，可作为慢性阻塞性肺疾病早期诊断、病情评估的重要指标 [18]。我们的研究结果显示AECOPD患者诱导痰中IL-8水平明显高于SCOPD，且与COPD患者GOLD分级呈正相关，这也说明了IL-8参与了COPD急性加重的过程，可反映气流阻塞程度。

本研究还发现COPD患者中有45%为嗜酸性粒细胞表型，这与文献报道 [26] 约50% COPD患者为嗜酸性粒细胞表型不一致，可能与本研究纳入病例数量少有关，需进一步大样本多中心研究证实。嗜酸性粒细胞在慢性阻塞性肺病患者中起着重要作用，嗜酸性粒细胞相关的气道炎症通过损伤气道粘膜的生理结构和功能参与COPD的发生发展，嗜酸性粒细胞水平较低的COPD患者气道炎症严重，住院时间延长，死亡率增加，CAT (COPD Assessment Test)和mMRC (呼吸困难评分)评分较高，预后较差 [27]。研究发现嗜酸性粒细胞组较非嗜酸性粒细胞组患者的痰微生物丰度显著降低 [5] [25]、IL-8和IL-6水平显著降低 [25]，本研究结果也证实诱导痰中Eos组IL-6、IL-8水平较Noneos组低。痰嗜酸性粒细胞升高可确定一组慢性阻塞性肺病受试者存在更严重的气流阻塞、更差的生活质量、更大的肺气肿和空气潴留以及恶化 [28]。这表明嗜酸性粒细胞性慢性阻塞性肺病预后良好，可据此对慢阻肺患者进行疾病评估及早期激素干预。

本研究结果提示我们可对COPD患者常规行诱导痰检测，并结合其中细胞因子及炎症细胞表型对患者及早进行病情严重程度的评估，并指导COPD患者激素的精准使用。但有报道ICS治疗COPD增加了肺炎的风险，且BMI < 25 kg/m²是增加肺炎的危险因素 [29]。因此我们在使用ICS时，不应单纯依靠辅助检查结果，还应具体结合临床实际合理应用。

作者贡献声明

曹晓红(山西医科大学附属汾阳医院)：提出诱导痰技术研究思路、设计研究方向，参与论文修订、论文最终版本修订。史秀枝(成都市第七人民医院)：收集病例资料、文献检索、分析文献、起草论文、撰写论文、按编辑部修稿意见进行核修。

利益冲突

所有作者均声明没有相互竞争的利益，财务或其他。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]