基于生物化学网络探讨山豆根干预哮喘的作用机制及物质基础

Study on the Mechanism and Material Basis of Sophora tonkinensis Gagnep on Asthma Based on Biochemical Network

摘要: 目的：研究山豆根(Sophora tonkinensis Gagnep)治疗哮喘的物质基础和作用机制。方法：首先对山豆根进行液相色谱–质谱联用分析，获得山豆根的化学成分，随后通过数据库TCMIP，获得山豆根成分所能预测的靶点。在CTD数据库中，查找出与哮喘相关靶点，通过韦恩图对山豆根化学成分的靶点与其哮喘相关靶点进行结合，得出二者相互交叉的部分，即为交集靶点。采用Cytoscape v3.8.0软件构建“成分–靶点–疾病”的网络关系，采用DAVID数据库对交集靶点进行KEGG通路分析。最后对交集靶点进一步分析，获得山豆根治疗哮喘的核心靶点。结果：获得127个交集靶点与12个山豆根治疗哮喘的活性成分，筛选出31条KEGG信号通路，进一步挑选出核心靶点7个。结论：本文对山豆根具有多成分、多靶点、多通路等特点的哮喘治疗方法进行了研究和分析，为今后哮喘的治疗提供了理论依据。

Abstract: Objective: To study the material basis and mechanism of Sophora tonkinensis Gagnep in the treat-ment of asthma. Methods: Firstly, the chemical constituents of Sophora tonkinensis Gagnep were analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry, and then the predicted targets of Sophora tonkinensis Gagnep were obtained by TCMIP database. In the CTD database, find out the asthma related targets, combine the targets of chemical components of Sophora tonkinensis Gagnep and its asthma related targets through Wayne diagram, and get the intersection part of the two. Those were the intersection targets. Cytoscape v3.8.0 software was used to construct the network relationship of “component-target-disease”, and DAVID database was used to analyze the KEGG pathway of the intersection targets. Finally, the intersection targets were further analyzed to obtain the core target of Sophora tonkinensis Gagnep in the treatment of asthma. Results: One hundred and twenty-seven intersecting targets and twelve active components of Sophora tonkinensis Gagnep were obtained, thirty-one KEGG signal pathways were screened, and seven core targets were further selected. Conclusion: This paper studied and analyzed the treatment of asthma with the characteris-tics of multi-components, multi-targets and multi-pathways, which provided a theoretical basis for the future treatment of asthma.

1. 引言

根据流行病学的调查，发现哮喘的患病概率具有普遍增加的趋势 [1]。哮喘患者呼吸困难，并常伴有胸闷，气喘等症状，严重影响了人们的生活质量。西医对哮喘的治疗，不良反应较大，而具有“辨证论治、整体观念”的中医特色治疗方法应运而生 [2]。

山豆根是豆科越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep)的干燥根和根茎，产地以广西、贵州为主。其药性苦寒，归肺经、胃经，中药本草中多记载了其功效为清热解毒、消肿利咽，临床常用于肺热咳嗽、火毒蕴结等症。通过对其临床应用与现代研究表明 [3] [4] [5] ，山豆根对哮喘有一定治疗基础，但其对哮喘的作用机制尚不清晰。运用生物化学网络的研究方法可以解决这一难题，它在中医药领域的应用广泛：不仅适合于单味中药的分析，如余丹等 [6] 运用生物化学网络研究补骨脂引起肝脏损伤的作用机制；而且也适合于中药复方分析，如刘嫣然等 [7] 采用生物化学网络探讨芍药甘草汤干预三叉神经痛的作用机制。本文同样采用生物化学网络的研究方法，对山豆根治疗哮喘的潜在作用机制与物质基础进行探究，这将为后续的临床推广和使用夯实基础。

2. 材料、仪器

2.1. 材料及试剂

山豆根药材由济仁堂中药饮片厂(中国贵阳，批号：20180101)提供。其凭证样本为(GUTCM-VS-2019 002)保存于贵州中医药大学药学院。甲酸、乙腈、甲醇均购自国药集团化学试剂有限公司。

2.2. 仪器

RE-5203型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器有限公司；DRHH-2型数显恒温水浴锅，上海双捷实验设备有限公司；800A微型粉碎机，鹤壁市永心电子科技公司；BK-F010T型冻干机，山东博科科学仪器有限公司；5427R型离心机，艾本德中国有限公司；ExionLC^TM AC型超高液相色谱仪，美国AB SCIEX公司；TripleTOF 5600型高分辨质谱仪，美国AB SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱，美国Milford Waters公司。

3. 方法

3.1. 山豆根提取物的制备

山豆根药材通过粉碎过筛加入十倍体积的蒸馏水回流提取2 h，将回流提取的液体再用滤纸过滤一次。对药渣再加入十倍体积的蒸馏水继续回流提取两次，同样每次2 h，并过滤。最后合并三次滤液，通过旋蒸仪对提取液进行浓缩，再制成冻干粉末至恒重，得到山豆根提取物，用于实验。

3.2. 山豆根提取物的液相–质谱检测

采用SCIEX-ExionLC^TM AC液相色谱(LC)系统和SCIEX 5600+Q-TOF质谱仪(MS)分析山豆根水提取物的色谱曲线。色谱分离在ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱上进行，柱温为40℃，流速为0.4 mL/min。水溶剂系统以0.1%的甲酸水溶液(流动相A)-0.1%乙腈(流动相B)进行梯度洗脱。洗脱程序为：5%~14%的流动相B，0~3分钟；14%流动相B，3~3.5分钟；14%~28%流动相B，3.5~5分钟；28%流动相B，5~6.5分钟；28%~60%流动相B，6.5~12分钟；60%流动相B，12~13.5分钟；60%~100%流动相B，13.5~18分钟；100%流动相B，18~25分钟。进样体积为5.0µL。

质谱分析检测条件：采用电喷雾离子源,离子扫描方式是正、负离子全扫描模式，MS (m/z)扫描范围为100~1200。MS/MS (m/z)扫描范围为50~1200。源参数设置如下：扫描类型TOF；源温度550℃；去集电位：90 v；雾化气压：150 psi；辅助气压：250 psi；气帘气压：35 psi；喷雾电压：正离子模式：5500 V、负离子模式：−4500 V，碰撞能差：在MS模式下为10 V，在MSMS模式为35 V/−35 V。

3.3. 山豆根提取物的数据分析

基于NIST和METLIN的MS/MS集成数据库，采用QI软件(2.4版，Waters，MA，USA)对山豆根的水溶液提取物进行成分鉴定。

3.4. 筛选山豆根有效活性成分与哮喘的靶点

通过液相色谱–质谱联用仪(LC-MS/MS)分析山豆根的主要有效成分，并进行山豆根的相关文献分析，将山豆根的化学成分代入TCMIP数据库(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Index/index)中，选择Candidate Target Genes这一栏，即为成分所能预测的靶点。根据成分靶点可能性，筛选0.9以上的靶点进行汇总。在CTD数据库(http://ctdbase.org/)获得哮喘相关靶点。采用韦恩图(Venny2.1.0)将山豆根化学成分的靶点与其哮喘有关的靶点相结合，得出二者相互交叉的部分，即为交集靶点。最后采用Cytoscape v3.8.0软件建立“成分–靶点–疾病”之间的关系。

3.5. KEGG通路富集分析

把交集靶点代入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)，选择研究对象为人类(Homo sapiens)，对KEGG通路进行分析，将错误发现率(FDR)值设为小于0.05。

3.6. 构建蛋白–蛋白互作(PPI)网络

把交集靶点代入String数据库(https://string-db.org/)，并建立PPI网络图。

3.7. 分析干预交集靶点的有效成分，筛选核心靶点

从交集靶点分析筛选得出干预这些靶点的山豆根治疗哮喘的有效成分，将交集靶点代入String数据库，获得蛋白相互关系的网络，把该网络导入软件Cytoscape v3.8.0，通过Degree值进行筛选，选择Degree值排名前7的靶点进行汇总，即为核心靶点。

4. 结果

4.1. 有效成分及靶蛋白的分析

山豆根的原植物(图1)经贵州中医药大学药学院李煦照副教授鉴定，为豆科越南槐(Sophora tonkinensis Gagnep)的干燥根和根茎。通过LC-MS/MS获得山豆根成分147个，其中包括黄酮类33个，生物碱类26个，有机酸类21个，苯丙素类12个，萜类8个，糖苷类7个，木脂素类6个，香豆素类4个，氨基酸类4个，糖类3个，酚类2个，甾体类1个，醌类1个，其他类19个。随后用TCMIP数据库获得山豆根的成分所能干预的靶点。以可能性取0.9以上靶点进行汇总，删除重复项后，获得山豆根成分所能预测的靶点139个。从CTD中得到哮喘有关的靶点。最后利用Venny2.1.0取山豆根的成分靶点和哮喘的有关靶点之间相互交叉的部分，获得交集靶点127个(图2)。采用Cytoscape v3.8.0软件对“成分–靶点–疾病”的网络进行构建(图3)。从交集靶点分析筛选得出干预这些靶点的山豆根治疗哮喘的有效成分12个，得出蛋白与蛋白之间相互作用的核心靶点7个(表1)。

Figure 1. Sophora tonkinensis Gagnep

图1. 山豆根的原植物

Figure 2. Venny diagram of the target of Sophora tonkinensis Gagnep for asthma intervention

图2. 山豆根干预哮喘的靶点Venny图

Figure 3. The network of “component-target-disease” of Sophora tonkinensis Gagnep in asthma intervention

图3. 山豆根干预哮喘的“成分–靶点–疾病”的网络

Table 1. Core targets of Sophora tonkinensis Gagnep in asthma intervention

表1. 山豆根干预哮喘的核心靶点

4.2. 通路富集分析

通过DAVID数据库对交集靶点进行分析，根据FDR < 0.05，得出31条KEGG信号通路。如图4所示，交集靶点在31条通路上富集。

Figure 4. Analysis of KEGG enrichment pathway of Sophora tonkinensis Gagnep in asthma intervention target

图4. 山豆根干预哮喘靶点的KEGG富集通路分析

4.3. 构建蛋白–蛋白互作网络

把交集靶点导入String数据库中，做出PPI网络，该关系图由294条边，127个节点所组成(图5)。

Figure 5. PPI network of Sophora tonkinensis Gagnep in asthma intervention target

图5. 山豆根干预哮喘靶点的PPI网络

5. 讨论

本文应用生物化学网络，对山豆根治疗哮喘的作用机制和物质基础进行了探究。呼出的一氧化氮(FENO)是气道炎症的生物标志物，FENO的上调表明气道具有炎症，气道炎症会引起哮喘的发生，诱导型NOS(NOS2)和内皮细胞NOS(NOS3)是NO合酶(NOS)的两种亚型 [8] ，它们可以促进NO的合成。已有研究 [9] 证实：哮喘患者与正常健康组相比，FENO的水平含量会更高，这归因于NOS2和NOS3的上调。表明NOS2和NOS3的上调会引起FENO的增加，进而介导哮喘。这提示我们可以抑制NOS2和NOS3的酶活性治疗哮喘。EOS可以促进组织损伤的颗粒蛋白的释放和气道对异物的免疫反应。IL-5是一种促炎细胞因子，抑制IL-5可以使气道和血液中EOS的浓度下降，IL-33的上调可以激活炎症的发生。上调IFN-γ可以调节哮喘患者的肥大细胞，使气道保持通畅，利于哮喘的治疗。SRC对哮喘的治疗相关机制 [10] 为抑制SRC的活性不仅可以下调IL-5和IL-33的水平，而且可以促进IFN-γ的活性增加，达到治疗哮喘的效果。ROS水平的升高会使哮喘病情恶化，增强SOD1的活性，可以下调ROS，从而抑制哮喘 [11]。维生素C和维生素E都可以下调ROS的水平 [12] ，提示我们多食用富含维生素C和维生素E的食物有利于哮喘的预防与治疗。IDH1的突变会引起ROS水平上升，进而引起哮喘，提示我们运用IDH1突变抑制剂可以有效治疗哮喘 [13]。PTGS2编码COX-2 [14] ，已有研究 [15] 表明，在哮喘患者中的COX-2含量增加，提示COX-2可以作为哮喘诊断的指标。

T淋巴细胞与气道炎症有关，而气道炎症会引起哮喘的发生。CD4⁺ T细胞属于T淋巴细胞中的一种。CD4⁺ T细胞活性增强不仅会介导多种炎性细胞因子的释放还能促进STAT6的水平上调。而STAT6的上调会恶化哮喘的严重程度 [16]。IL-17是一种炎症介质，它不但能引起多种细胞释放炎性因子，而且可以促进其他炎症细胞因子的表达。地奥司明可下调CD4⁺和IL-17的水平，进而减弱气道炎症程度，抑制哮喘的发生 [17]。吸烟与哮喘有关，研究发现 [18] ，不吸烟的哮喘患者比吸烟的哮喘患者肺功能好，而且其哮喘发作频率与致死率均比吸烟的哮喘患者低。金雀花碱 [19] 由于其化学结构，药理作用与尼古丁相似，而且它安全性好、脂溶度强，易透过血脑屏障。故可作为一种戒烟药物 [20] ，这无疑给吸烟的哮喘患者带来福音，减弱了吸烟对哮喘的危害。肿瘤坏死因子(TNF-α)可以启动哮喘炎症过程，它可以上调呼吸道血管内皮细胞增加粘附分子的表达，促进IL-1、IL-8和PAF浓度增加，进而引起炎症反应 [21] ，而且已有研究表明 [22] ，健康正常人群中TNF-α的浓度低于哮喘患者。这充分佐证了我们的观点：降低TNF-α的水平可以抑制哮喘。NO对哮喘的作用呈现双重作用，低浓度NO可以使平滑肌松弛，而高浓度NO能诱发肺部损伤和气道炎症。在正常健康人群中，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性低于哮喘患者，哮喘患者中高水平的iNOS会促进NO浓度升高，进而诱发哮喘；而哮喘会触发多种炎症因子，进而引起iNOS增加，这种恶性循环源源不断的产生 [23]。柚皮苷 [24] 可以降低iNOS的表达水平和减弱TNF-α的分泌，进而抑制哮喘的发生。柠檬酸作用于哮喘的机制复杂，当柠檬酸进入机体后，会引起低pH的环境，酸性环境会诱导缓激肽的形成。缓激肽具有两个功能：一是缓激肽可以介导感觉神经末梢释放速激肽，速激肽会引起神经源性炎症，咳嗽和支气管平滑肌细胞的收缩，进而诱发哮喘。二是缓激肽可以释放NO，NO对支气管具有保护作用，从而抑制哮喘。L-精氨酸作用哮喘的机制主要与NO和炎症有关 [25]。L-精氨酸的代谢有两条途径，一是在精氨酸酶的作用下，L-精氨酸可以产生L-鸟氨酸和尿素。二是参与L-瓜氨酸/L-精氨酸循环，在这个循环过程中，可产生NO，利于支气管扩张。因此代谢途径存在相互竞争底物L-精氨酸的关系。已有研究证明 [26] ，在哮喘患者中，精氨酸酶的活性更强，导致L-精氨酸代谢途径二中NO产生匮乏，NO的减少会引起气道炎症，更加重哮喘的严重程度。提示我们可以通过抑制精氨酸酶的活性，从而减轻哮喘的严重程度。大豆苷作用于哮喘的机制主要与白三烯和气道粘液相关。哮喘患者的平滑肌收缩，就会不断产生气道粘液，从而引起气道受阻，使哮喘患者呼吸更加困难 [27] ，白三烯的释放会引起哮喘的发生 [28]。大豆苷不仅能对白三烯的释放呈现抑制作用 [29] ，而且可以减少气道粘液的产生 [30]。气道炎症会引发哮喘，其相关机制 [31] 为T细胞产生Th2型细胞因子，这些细胞因子会引起嗜酸性粒细胞进入肺组织，这些嗜酸性粒细胞会介导气道炎症，引起哮喘。獐牙菜苷具有抗炎的药效，便可以抑制炎症而达到治疗哮喘效果 [32]。烟酸 [33] 本身无毒，对哮喘的治疗，不良反应罕见，而且很少产生耐药性，是一种优良的抗哮喘药物，值得开发与应用。

6. 结论

综上所述，本研究通过生物化学网络对山豆根治疗哮喘的物质基础和作用机制进行探讨和研究，发现山豆根对哮喘的治疗呈现多成分、多靶点、多通路的特点，这为后续山豆根在临床上的应用提供了理论依据。

基金项目

国家自然科学基金项目(8196140426)。

参考文献