夏枯草配方颗粒制备及质量测定研究

Study on Preparation and Quality of Prunella vulgaris Formula

摘要: 目的：筛选夏枯草配方颗粒制备工艺及进行颗粒剂中齐墩果酸含量测定研究。方法：采用正交实验优化方法筛选出最佳颗粒剂制备工艺，HPLC法测定颗粒剂中齐墩果酸的含量，同时对制成的九批夏枯草颗粒进行微生物限度检查。结果：筛选出了夏枯草配方颗粒的最佳制备工艺。齐墩果酸在0.8 μg3.2 μg范围内呈良好线性关系，线性方程为y =577891x − 826.9，相关系数r = 0.9998，平均回收率100.25%，RSD 1.5%。九批夏枯草颗粒的微生物限度检查结果均符合药典颗粒剂项下微生物限度相关规定。结论：该工艺稳定可控操作简便，可为夏枯草配方颗粒制备及质量研究提供实验依据。

Abstract: Objective: To screen the preparation technology of Prunella vulgaris formula granules and determine the content of oleanolic acid in the granules. Methods: Orthogonal experiment was used to op-timize the preparation process of the granules. The content of oleanolic acid in the granules was determined by HPLC, and the microbial limit of nine batches of Prunella vulgaris granules was examined. Results: The best preparation technology of Prunella vulgaris formula granules was screened out. Oleanolic acid showed a good linear relationship in the range of 0.8 μg~3.2 μg. The linear equation is y = 577891x − 826.9, the correlation coefficient is r = 0.9998, the average recovery is 100.25%, RSD 1.5%. The microbial limit test results of nine batches of Prunella vulgaris granules were in line with the relevant provisions of the pharmacopoeia on microbial limit of gran-ules. Conclusion: The process is stable, controllable and simple, which can provide experimental basis for the preparation and quality study of Prunella vulgaris formula granules.

1. 引言

夏枯草(Prunella vulgaris L.)隶属于唇形科(Labiatae)野芝麻亚科(Lamioideae)夏枯草属(Prunella)，夏枯草药用部位为干燥果穗，也常全草入药，是中医临床常用的一味中药 [1]。夏枯草具有多种药理作用(降血糖，降血压，降血脂，抗菌抗病毒，抗突变，抗肿瘤，抗炎及对免疫系统等) [2] [3] [4] [5] [6]。夏枯草的化学成分主要是齐墩果酸、熊果酸和迷迭香酸等多种有机酸 [7]，其中齐墩果酸属于五环三萜类化合物，药理作用广泛，不仅具有护肝、消炎抑菌和解肝毒作用，而且有增强机体免疫力的作用 [8]。

中药配方颗粒，原名为颗粒型饮片，又称免煎中药。可直接用于处方调配，是汤剂现代化的一种形式。具有剂量小，速效及携带、贮存、服用方便等特点。在中药颗粒剂制备工艺的研究中，药物和辅料的性质、药材的提取、纯化、制粒方法等对制剂的成型性和稳定性至关重要。近年来对夏枯草中有效成分的分离纯化及含量测定的文献较多 [9] [10] [11] [12]，鲜有夏枯草颗粒制备及其质量研究的报道。本实验以夏枯草配方颗粒合格率为指标，通过正交优化实验进行了夏枯草配方颗粒处方筛选及颗粒剂中齐墩果酸的含量测定研究。

2. 材料

试药与仪器

夏枯草(重庆市中药材市场)，齐墩果酸标准品(纯度 ≥ 98%，购于成都格利普生物技术有限公司)；糊精，淀粉，乙醇为药用级；磷酸为市售分析纯，甲醇为市售色谱纯。

LC-20AD高效液相色谱仪(岛津)，METTLER AE200S万分之一天天平(梅特勒–托利多仪器有限公司)，WXH微型涡旋混合器(上海跃进医疗器械厂)，移液枪(10~100 μL, 200~1000 μL) (DRAGON LAB)，超纯水系统Milli-Q (millipore S.A.S 67120 Molsheim-France facility)等。

3. 方法与结果

3.1. 夏枯草提取物的制备

称取夏枯草100 g，置于2000 mL单口圆底烧瓶里，再加入8倍质量的95%乙醇，经过1小时回流提取后，过滤并收集滤液，转移到2000 mL单口圆底烧瓶中；再次加入8倍量的95%乙醇回流提取1 h，重复3次，收集合并三次提取液，得到褐色澄清液体。通过减压浓缩，获得夏枯草提取物浸膏，其特征为褐色的黏稠状膏体，备用。

3.2. 颗粒剂的制备

将夏枯草提取物浸膏置于60℃的烘箱中干燥，得到红棕色浸膏粉备用；取出相应的辅料与浸膏粉过5号筛混匀，加入相应浓度的乙醇润湿剂制成软材，通过14目筛挤出，湿颗粒在相应温度下恒温干燥1 h，10目筛整粒，得到干燥的夏枯草颗粒。

3.3. 评价指标

考察指标是夏枯草颗粒的成型率，即：通过1号筛与未过5号筛的颗粒重占颗粒总重的百分比，按下式计算成型率(%)。

$成型率\left(\%\right)=\frac{通过1号筛的颗粒重量+未过5号筛的颗粒重量}{颗粒总重量}\times 100\%$

3.4. 正交试验设计

以辅料配比(糊精/可溶性淀粉)、浸膏粉与辅料配比、润湿剂的浓度、干燥温度为影响因素，采用正交试验设计L₉(3⁴)，筛选出夏枯草颗粒制剂的最佳工艺。正交试验因素水平设计及试验结果示于表1与表2。

Table 1. Design of each factor

表1. 因素水平设计

取夏枯草提取物根据表2加入辅料，混合，加入润湿剂，搅拌，制软材，制粒，干燥。计算颗粒合格率和选择最佳制粒工艺，结果示于表2。

Table 2. Orthogonal experiment design and results

表2. 正交实验设计与结果

根据综合评分结果，影响成型效果的各种因素为：C > B > A = D，与直观分析相结合，A₃ > A₂ > A₁，选择A₃，B₂ > B₁ > B₃，选择B₂；C₃ > C₂ > C₁，选择C₃；D₁ > D₃ > D₂所以，最佳工艺参数为A₃B₂C₃D₁。结合方差分析(表3)，乙醇浓度对于夏枯草配方颗粒制剂的可成形性具有显著性的影响，而辅料(糊精/可溶性淀粉)配比和浸膏粉与辅料配比，这两个因素对于颗粒制剂的成型性影响不显著。由此可得，制备夏枯草配方颗粒的最优成型工艺为辅料(糊精/可溶性淀粉)配比为1:4，浸膏粉与辅料配比为1:1，乙醇浓度为80%，干燥温度为55℃。

Table 3. The result of ANOVA

表3. 方差分析结果

3.5. 正交设计验证试验

按夏枯草浸膏粉与辅料(糊精:可溶性淀粉 = 1:4) = 1:1，加入润湿剂乙醇浓度为80%，恒温干燥的温度为55℃，根据“3.2”的制备方式制备3批供试品，测定颗粒成型率，结果表明该工艺稳定(表4)。

Table 4. Results of experimental validation

表4. 验证实验结果

3.6. 夏枯草配方颗粒中齐墩果酸质量分数测定研究

3.6.1. 色谱条件

色谱柱：Boston C₁₈ (250 mm × 4.6 mm, 5 μm )；甲醇-0.1%磷酸水溶液(86:14)等度洗脱；流速:1.2 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：室温。

3.6.2. 对照品溶液的制备

精密称取一定量的齐墩果酸对照品，加入甲醇溶液溶解稀释制成浓度为0.2 mg/mL的溶液，备用。

3.6.3. 供试品溶液的制备

取夏枯草配方颗粒适量，研磨成细粉，称取50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，通过超声波溶解，摇匀，制得5 mg/mL的溶液，冷至室温，用甲醇补定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，备用。

3.6.4. 专属性实验

取“3.6.2”项下的对照品溶液，“3.6.3”项下的供试品溶液，按“3.6.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。

(A)(B)

Figure 1. The HPLC diagram of the control products and the test products (A. Nut acid control; B. Test product)

图1. 对照品、供试品HPLC图(A、齐墩果酸对照品；B、供试品)

3.6.5. 线性关系考察

表精密吸取“3.6.2”项下对照品溶液4 μL，6 μL，8 μL，10 μL，12 μL，根据“3.6.1”项下的色谱条件测定。以齐墩果酸的进样量(x, μg)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，得线性范围为0.8 μg~3.2 μg，回归方程y = 577891x − 826.9，相关系数r = 0.9998。

3.6.6. 精密度试验

取“3.6.2”项下适量的对照品溶液，根据“3.6.1”项下色谱条件顺次进样6次测定。齐墩果酸峰面积的RSD为0.53%，结果表明仪器的精密度较好。

3.6.7. 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按“3.6.1”项下色谱条件测定，分别于0，3，6，9，12 h后进样测定齐墩果酸峰面积，其相对标准偏差RSD为1.7%，表明样品溶液在12 h内稳定。

3.6.8. 重复性试验

取样品6份，按“3.6.3”项下方法制备供试品溶液，再根据“3.6.1”项下色谱条件测定。齐墩果酸含量RSD为1.6%，符合药典要求。

3.6.9. 回收率

精密称取3份已知含量的样品，按“3.6.3”项下方法制备供试品溶液，按照药典规定分别加入一定量(80%、100%、120%)齐墩果酸的标准品，然后根据“3.6.1”项下色谱条件测定，计算样品的回收率为1.5%，结果见表5 (n = 3)。

Table 5. Results of the recovery rate experiment

表5. 回收率实验结果

3.6.10. 样品含量测定

精精密称取9批次夏枯草配方颗粒适量，供试品溶液制备同“3.6.3”项下所述方法，在“3.6.1”项下的色谱条件进样测定并计算其含量(表6)，结果表明采用该方法制备的夏枯草颗粒齐墩果酸质量分数是稳定的。

Table 6. Sample content determination results (n = 9)

表6. 样品含量测定结果(n = 9)

4. 微生物限度检查

验证上述投料生产的9批夏枯草配方颗粒(批号为202205-1~4、202206-1~5)，参照2020版《中国药典》四部颗粒剂项下相关规定，进行本品初步的质量研究，结果表明，该生产工艺重现性好，制备的夏枯草颗粒稳定可控，符合药典颗粒剂项下微生物限度相关规定(表7)。

Table 7. Results of microbial limits of Prunella vulgaris formula granules

表7. 夏枯草配方颗粒微生物限度检查结果

5. 结果

本试验是通过乙醇回流得到夏枯草提取物，并对夏枯草配方颗粒的制备工艺进行了正交优化实验，筛选出夏枯草配方颗粒的最优制备工艺为：辅料配比(糊精/可溶性淀粉)为1:4，浸膏粉与辅料配比为1:1，乙醇浓度为80%，干燥温度为55℃。采用HPLC法对夏枯草颗粒剂中齐墩果酸进行含量方法学研究及样品含量测定，结果表明，该方法精密度、稳定性和重复性良好，其RSD分别为0.53%、1.7%和1.6%，平均回收率为100.25%。结果表明该工艺重现性好，制备的夏枯草配方颗粒稳定可控，可以为夏枯草制剂开发提供一定的思路。

6. 讨论

本项目通过正交实验优化方法筛选出了夏枯草配方颗粒最佳制备工艺，进行了药品微生物限度检查，其结果符合药典颗粒剂项下微生物限度相关规定，但是夏枯草本身具有抗菌药理作用 [13]，后续试验可设置夏枯草颗粒不同浓度梯度来进行夏枯草颗粒的微生物限度检查。药品微生物限度是药品质量控制的重要指标之一，中药制剂由于药材的来源复杂且生产流程较长，尤其容易受到微生物的污染，更应引起高度重视。

合适的辅料是颗粒剂制剂工艺的关键步骤，经预试验发现，单一辅料或制粒困难或无法制得理想的颗粒，因此本实验选用混合辅料。夏枯草气微香、味甘、微苦，为工业化生产、市场推广考虑，辅料中可加入矫味剂，增加其口感。

本研究对夏枯草配方颗粒最佳制备工艺和质量控制进行了初步探索，为夏枯草颗粒制剂开发奠定了基础。若要进行工业化生产，需要进行进一步的药理毒理学研究、全面的质量标准制定以及制备工艺的深入研究。

基金项目

重庆市科委重点项目(CSTC2014zkjccxyyBX0034)；

重庆市博士后研究项目特别资助；

重庆市自然科学基金面上项目(cstc2021jcyj-msxm)。

NOTES

^*通讯作者。