1. 引言
疲劳(fatigue)是一种生理信号，通常与组织损伤以及能源短缺有关，而疲劳感则为主观之感受，通常以「累」、「提不起劲」等被形容。疲劳或疲劳感是逐渐开始，与虚弱(weakness)不同，其可以通过休息来缓解 [1]。运动上的疲劳是最常见也最容易被观测的，运动引起的肌肉疲劳最明显的征状为肌肉力量的下降，伴随一些生理数值的变化，像是血乳酸(lactate)的堆积、血氨(blood ammonia)浓度升高等 [2]。当承受运动或其他类型的压力挑战后所发生的这些疲劳指标获改善，像是电解质(electrolyte)、能量补充剂(energy supplement)等的补充，生理上的疲累感也相对可较快得到恢复，达舒缓疲劳的功效。
益生菌(probiotics)被定义为活的非病原性微生物，且给宿主(包括胃肠道)带来健康益处 [3]。最初益生菌的益处被认为仅限于肠道微生物的平衡，现有大量证据表明益生菌可透过调节免疫功能，提升人体对于病原菌的抵抗力 [4] [5]。目前最常用的益生菌菌株以乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)占大部份，过去研究LAB除了调节过敏、减缓肠道发炎，亦有抗氧化活性等 [6] [7] [8]。近年更是兴起益生菌对运动表现影响的相关研究 [9]。像是植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) PL-02的补充，在动物试验中被证实具提升肌肉量、运动表现，以及抗疲劳的效果 [10] [11]。唾液乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius) SA-03的补充，在动物试验中发现具降低血氨、肌酸磷化酵素(creatine kinase)等疲劳指标，达增进运动耐力的效果 [12]。
市场趋势上，也越来越多运动员以益生菌作为营养补充剂，以提高运动表现并减少运动后的疲劳感。因应不同益生菌菌株的功效性会有所不同，本实验由「葡萄王生技股份有限公司」所提供之乳酸菌，透过小鼠抗疲劳检测平台，针对乳酸菌介入后，评估具加速运动表现恢复或增强承受运动挑战能力之益菌。
2. 材料与方法
2.1. 菌株培养与制备
实验乳酸菌菌株共6株，由葡萄王生技股份有限公司(Grape King Bio Ltd., Taoyuan, Taiwan)提供，皆为可食用、可量化、安全的菌株。分别为：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) GKJ1、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum) GKK1、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) GKK3、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) GKK4、短乳酸杆菌(Levilactobacillus brevis) GKEX，以及鼠李糖杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus) GKY5。
实验菌株培养于1 L之MRS培养基(Difco, BD, USA)中，静置37℃培养16小时后，以25℃、5000 rpm (Heraeus Megafuge 40R, Thermo Fisher Scientific Inc., USA)离心10分钟取得菌泥，混入20%脱脂奶粉，再冷冻干燥而取得活菌菌粉。菌粉皆保存于4℃，供后续动物实验使用。
2.2. 试验动物与饲养
本试验之实验动物自台湾乐斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO Co., Ltd., Taiwan)购入6周龄ICR雄鼠35只，平均体重约30公克。动物饲育室温度控制22℃ ± 2℃，湿度控制65% ± 5%，光照与黑暗各控制12小时(06:00~18:00为光照期，18:00~06:00为黑暗期)。
2.3. 动物实验设计
小鼠经两周适应期后，按体重大小S型排序方式分为7组，每组5只。分别为空白对照组(Vehicle)、乳酸菌GKJ1组、乳酸菌GKK1组、乳酸菌GKK3组、乳酸菌GKK4组、乳酸菌GKEX组，以及乳酸菌GKY5组。益生菌以21 mg/kg b.w./day之剂量连续39天管喂小鼠，空白对照组则以灭菌水代替之。每周测量小鼠体重变化，并于试验第29至39天内进行运动耐力、运动疲劳程度分析(图1)。包含前肢抓力、游泳力竭测试、跑步力竭试验、运动后血乳酸与血尿素(blood urea nitrogen, BUN)浓度，及肝脏与肌肉之肝醣含量。
2.4. 前肢抓力(Forelimb Grip Strength)试验
传统的前肢握力测试是评估囓齿动物骨骼肌功能的一种方式 [13]。为研究补充乳酸菌后对于肌力是否具有提升之效果，于第29天喂食乳酸菌后30分钟进行前肢抓力测试(forelimb grip strength)。其将小鼠前肢放置于动物抓力测试仪(Grip Strength Meter, Model-RX-5; Ailoh Engineering, Nagoya, Japan)之测量杆(直径2 mm，长度7.5 cm)上，当小鼠抓紧杆子后，以手拉动小鼠尾部使仪器测量小鼠抓力变化过程中的最大抓力，以公克(g)表示之。
2.5. 负重游泳力竭试验(Exhaustive Swimming Exercise)
试验前一周先让小鼠进行游泳适应。于第31天采小鼠体重5%的铅片绑于小鼠尾巴上进行负重游泳力竭试验。小鼠游泳前禁食12小时，并于喂食乳酸菌后30分钟，将小鼠放入水缸(直径28 cm、水深25 cm、水温27温cm水)中，强迫试验动物进行游泳运动。在整个实验过程中应使试验动物四肢保持运动，如果试验动物漂浮在水面四肢不动，可用搅拌棒在其附近搅动。记录试验动物头部完全没入水中持续8秒不浮出水面为止的时间，为负重游泳运动之力竭时间。
2.6. 跑步力竭试验(Exhaustive Running Exercise)
于试验第33天进行跑步运动力竭试验。测验时，每只小鼠一个轨道，并于轨道末端设置电击区，强迫试验动物进行跑步运动，跑步机的条件参考过去文献 [14]，起始速度为10 m/min、坡度为5%，5分钟后每分钟增加2 m/min的速度直到小鼠落入电击区超过5秒无法继续向前，则判定为力竭，并纪录开始跑步至力竭之时间。
2.7. 运动后之血液生化分析
本试验以检测血乳酸和BUN做为评估运动后的疲劳指标。采血后离心之血清样品以血液自动分析仪(Hitachi 7060, Hitachi, Tokyo, Japan)进行检验。采血时间与状态分别如下：
2.7.1. 血乳酸分析
于试验第35天喂食乳酸菌后30分钟进行不负重水中(温度30℃ ± 1℃)游泳10分钟后停止。分别在游泳前、游泳后，以及游泳后休息20分钟后采血0.2 mL，共采三个时间点血液作为血乳酸分析。
2.7.2. 血尿氮素分析
于试验第37天喂食乳酸菌后30分钟采血0.2 mL为运动前之血尿素氮浓度纪录，接着将老鼠放入水中(温度30℃ ± 1℃)进行不负重游泳90分钟，再使之休息60分钟后采血，进行运动后且休息后之血尿素氮浓度分析。
2.8. 肝脏与肌肉之肝醣含量分析
于试验第39天末次喂食乳酸菌后30分钟将所有动物进行牺牲。采集小鼠肝脏与后肢小腿肌肉，并以生理盐水清洗后，拭干秤重，并加入5倍体积(w/v)的组织均质液，使用组织均质机Bullet Blender (Next Advance, Cambridge, MA, USA)将不同组织进行均质化。均质后的样品于4装至、12,000心管离心15分钟，取上层萃取液以市售ELISA Kit进行肝醣含量分析。另以市售肝醣(Glycogen Sigma)标准品进行检量线之制作，藉以计算不同组别动物肝脏与肌肉组织中肝醣储存量之情形。
2.9. 统计分析
所有数值以平均值±标准误差(Mean ± S.E.M.)表示，每组小鼠数量皆为5只。采用Microsoft Excel 2010进行独立样本t检定比较Vehicle与测试样品组之差异，并以p < 0.05代表具有统计上之意义。
3. 结果
表1为试验期间小鼠的体重变化，试验开始前各组体重无明显差异，实验期间各组体重皆稳定持续增加，试验结束体重亦无组间差异，故本试验所使用6种不同乳酸菌不会对动物造成副作用而影响其生长。
Table 1. Mice body weight changes (g) during the experiment
表1. 实验期间各组小鼠体重变化情形
Values were expressed as mean ±S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5).
3.1. 不同菌株对小鼠前肢抓力之影响
为了比较不同菌株对于提升肌力之效益，于实验介入第4周后进行前肢抓力测试。结果如图2所示。补充乳酸菌的组别，除GKJ1组外，前肢抓力数值(g)皆有比Vehicle组高的趋势。其中又以菌株L. plantarum GKK1、L. rhamnosus GKY5、以及L. brevis GKEX较果较佳，与Vehicle组相比具统计上显著差异，说明这些菌株有助于提升小鼠前肢抓力。
1Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5); 2Symbols indicate significance when compared to the vehicle (*p < 0.05; **p < 0.01).
Figure 2. Comparison the effect of different strains on forelimb grip strength
图2. 比较不同菌株对于提升前肢抓力表现
3.2. 不同菌株对小鼠运动耐力之表现
游泳力竭运动表现的结果，如图3(a)所示。Vehicle组在负重游泳约5分钟左右达到力竭，无法继续泳动，而补充菌株L. brevis GKEX、L. plantarum GKK1、L. rhamnosus GKY5，以及P. acidilactici GKK4，可分别观察到其游泳力竭时间增加，说明这些菌株的补充可提升运动耐力。
跑步机力竭测试结果如图3(b)所示。除GKJ1组外，与Vehicle相比，连续补充测试之菌株皆有助于提升跑步力竭的时间，增加小鼠的运动耐力表现。
(a) (b)1Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5); 2Symbols indicate significance when compared to the vehicle (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).
Figure 3. The effect of the different strains on exercise endurance: (a) force swimming exercise (min); (b) force running exercise (min)
图3. 不同菌株对于运动耐力之表现：(a) 游泳力竭试验(min)；(b) 跑步力竭试验(min)
3.3. 不同菌株对于运动前后与运动休息后之血乳酸变化
由表2结果可以得知，在游泳前各组的血乳酸浓度皆无显著差异(p > 0.05)。单次不负重游泳10分钟后，各组之乳酸浓度皆有上升的情形，而补充乳酸菌之组别皆可维持显著较低的血乳酸。其中与Vehicle相比，依序以菌株P. pentosaceus GKK3 (p < 0.001)、L. rhamnosus GKY5 (p < 0.01)、L. brevis GKEX (p < 0.01)、L. plantarum GKK1 (p < 0.01)、P. acidilactici GKK4 (p < 0.05)以及L. plantarum GKJ1 (p < 0.05)的血乳酸浓度上升程度较小。在此，根据游泳前(A)与游泳10分钟后(B)这两个时间点的血乳酸浓度，可计算出乳酸升高比值(rate of lactate production)：
(1)
以乳酸升高比值(B/A)来看，与Vehicle相比，补充菌株P. pentosaceus GKK3、L. brevis GKEX、L. plantarum GKK1、L. rhamnosus GKY5及 P. acidilactici GKK4的组别，其乳酸升高比值具显著减少，说明上述试验菌株具有提升运动耐力的潜力。其中又以菌株GKK3、GKEX及GKK1的乳酸升高比值降低效果最为显著(p < 0.01)。
Table 2. The effects of the different strains on the changes of lactate after short-time exercise
表2. 比较不同菌株对于短时间运动后乳酸变化情形
1Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5); 2Symbols indicate significance when compared to the vehicle (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; #p = 0.05).
此外，分析游泳10分钟后再休息20分钟之血乳酸浓度结果显示(C)，各组之乳酸浓度皆有下降的情形。其中，依序以菌株、L. rhamnosus GKY5 (p < 0.001)、L. plantarum GKK1 (p < 0.001)、L. brevis GKEX (p < 0.01)、P. pentosaceus GKK3 (p < 0.01)、P. acidilactici GKK4 (p < 0.01)以及L. plantarum GKJ1 (p < 0.05)与Vehicle相比，能在运动休息后维持较低的血乳酸浓度。以游泳10分钟(B)及休息20分钟后(C)这两个时间点的血乳酸浓度，可以计算出乳酸消除比值(rate of lactate clearance)：
(2)
从乳酸消除比值来看，试验菌株之乳酸消除比皆略高于Vehicle组，即便没有达到统计上的差异。仅有补充L. brevis GKEX的组别，其乳酸消除比值比Vehicle组显著提升约2.3倍(p = 0.05)，说明菌株L. brevis GKEX在相同运动时间内能快速恢复身体血乳酸平衡，较能减缓疲劳的效果。
3.4. 不同菌株对于运动休息后之血尿素氮浓度之影响
各组小鼠运动前之血尿素氮浓度并无组间差异(表3)，在单次90分钟不负重游泳运动后且休息60分钟之血尿素氮浓度皆成增加的趋势。与Vehicle组相比，补充各乳酸菌菌株L. brevis GKEX (p < 0.01)、P. pentosaceus GKK3 (p < 0.01)、L. rhamnosus GKY5 (p < 0.05)以及P. acidilactici GKK4 (p < 0.05)，其运动后且相同休息时间下的血尿素氮浓度明显较低，说明这些菌株的补充有助于体力快速的恢复。
Table 3. Comparison of different strains in changes of the BUNlevel at 60 minutes rest after long-term exercise challenge
表3. 比较不同菌株对于长时间运动挑战后休息60分钟血中尿素氮变化情形
1Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5); 2Symbols indicate significance when compared to the vehicle (*p < 0.05; **p < 0.01).
3.5. 不同菌株对于肝脏及肌肉组织中肝醣含量之影响
为了了解补充不同菌株是否具有增加体内组织中重要能量储存物质肝醣之含量，于实验最后一次喂食结束30分钟之后，将小鼠予以牺牲。取肝脏与腿部肌肉组织进行肝醣含量之分析。在肝脏部位肝醣(liver glycogen)含量的结果如图4(a)所示，以乳酸菌菌株L. plantarum GKK1 (p < 0.001)和L. brevis GKEX (p < 0.01)组之肝脏肝醣含量显著高于Vehicle组，说明此两株菌株有助于能量的储存。肌肉部位肝醣(muscle glycogen)含量的结果如图4(b)结果所示，与Vehicle组相比，补充菌株L. plantarum GKK1 (p < 0.01)、P. pentosaceus GKK3 (p < 0.05)以及P. acidilactici GKK4 (p < 0.05)显著提升肌肉部位肝醣含量，说明这些试验菌株有助于肌肉能量的利用。
(a) (b)1Values were expressed as mean ± S.E.M. and analyzed by t-test (n = 5); 2Symbols indicate significance when compared to the vehicle (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).
Figure 4. The effect of the different strains on glycogen level: (a) liver; (b) muscle
图4. 比较不同菌株之肝糖含量：(a) 肝脏；(b) 肌肉
4. 讨论
益生菌对运动员具有潜在益处，包括提升蛋白质中氨基酸等关键营养物质的吸收、避免因训练负荷过大、心理压力、睡眠不佳、或在极端环境中而增加呼吸道与肠胃道感染的风险等 [15] [16]。虽大多研究早期着重于运动员免疫与肠胃道间的关系，近期研究显示补充益生菌可改善运动时的表现与运动后的恢复情形 [17]。因此，本试验采用小鼠动物模式来评估数株乳酸菌是否具有提升运动表现与抗疲劳的效果。试验设计共39天的总实验流程，在连续补充乳酸菌后，针对运动挑战的强度与时间，由低强度至高强度、由短时间至长时间，采血进行各项运动能力与疲劳相关的生化指标分析。
Table 4. Summary of the test results of lactic acid bacteria strains in anti-fatigue animal models
表4. 总结抗疲劳动物模型中测试的乳酸菌菌株试验结果
↑ or ↓ indicate significance when compared to the vehicle.
补充菌株L. plantarum GKK1组之小鼠在肝脏肝醣分析结果中显著比Vehicle组高约1.6倍，在肌肉肝醣分析结果中显著比Vehicle组高约1.3倍(图4)。因肝脏肝醣可以分解成葡萄糖，并释放到血液，供给肌肉以及其他器官，负责维持稳定的血糖浓度，是提供身体能量的重要来源 [18]，因此初步推测菌株L. plantarum GKK1可协助参与身体能量的储存与运用。补充菌株L. brevis GKEX在短时间运动后的乳酸升高比值较Vehicle组显著降低约0.7倍，在短时间运动后且休息后的乳酸消除比值较Vehicle组显著提升约2.3倍(表2)。由于乳酸的堆积会干扰神经冲动的传导、肌肉的收缩和肌肉收缩的能源，因而产生疲勞，又乳酸的生成与清除与有氧代谢能力有关 [19]，因此初步推测菌株L. brevis GKEX具有提升身体的代谢能力。
综合评估所有运动疲劳指标之结果显示于表4，以菌株L. plantarum GKK1与L. brevis GKEX在各运动表现中有较好的效果，后续可开发机能性乳酸菌L. plantarum GKK1或L. brevis GKEX针对提升运动表现与抗疲劳的保健补充品。
5. 结论
本实验证实，持续补充乳酸菌L. plantarum GKK1与L. brevis GKEX有助于提升运动耐力及降低运动疲劳指标。此外，亦可提升肝脏及肌肉中的肝醣含量。经动物实验结果明确显示，菌株L. plantarum GKK1与L. brevis GKEX有促进运动表现提升与抗疲劳的效果适合发展全年龄者的运动保健素材。
NOTES
*通讯作者。