PCPA失眠大鼠大脑皮质中PACAP信号的表达及酸枣仁汤的干预作用

Expression of PACAP Signals in the Cerebral Cortex of PCPA Insomnia Rats and the Interaction Effect of Suanzaoren Decoction

摘要: 目的：采用氯苯丙胺酸(PCPA)制作失眠大鼠模型，观察其大脑皮质中的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、PACAP R1A以及受体后信号蛋白PKC mRNA表达变化情况及酸枣仁汤(SZRD)的干预作用。方法：64只大鼠分成7天正常组，7天对照组、7天PCPA组、15天正常组、15天对照组、15天PCPA组、SZRD组、PCPA + SZRD组，腹腔注射PCPA，予酸枣仁汤灌胃治疗，应用RT-PCR测定PACAP、PACAPR1A以及PKC mRNA表达含量的变化。结果：7天PCPA组、15天PCPA组大鼠大脑皮质中PACAP、PACAPR1A及PKC mRNA的表达量均显著降低(P < 0.05)。SZRD干预治疗后，三者相对表达量则显著增加。结论：PCPA致失眠的机制可能与PACAP信号表达含量的降低有关，SZRD能够促使PACAP信号表达增加，从而达到治疗失眠的效果。

Abstract: Objective: The insomnia rat model was established by chloramphetamine acid (PCPA). The changes of PACAP, PACAP R1A and PKC mRNA expression in the cerebral cortex and the intervention effect of SZRD were observed. Methods: Sixty-four rats were divided into 7 days normal group, 7 days control group, 7 days PCPA group, 15 days normal group, 15 days control group, 15 days PCPA group, SZRD group and PCPA + SZRD group. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of PACAP, PACAPR1A and PKC. Results: The expression of PACAP, PACAPR1A and PKC mRNA in the cerebral cortex of rats in the 7-day PCPA and 15-day PCPA groups were significantly reduced (P < 0.05). The relative expressions of PACAP, PACAPR1A and PKC mRNA were significantly increased after the intervention of SZRD. Conclusions: The mechanism of PCPA causing insomnia may be related to the decrease of PACAP signal expression, and SZRD can induce the increase of PACAP signal expression, thus achieving the effect of treating insomnia.

1. 引言

失眠严重危害人类身心健康，加强失眠的发病机制及治疗研究很有必要 [1] 。PACAP作为一种下丘脑促垂体激素，具有视神经下丘脑束共同传递体的作用。PACAP及其受体通过Ca²⁺、Na⁺、腺苷酸环化酶或磷酸肌醇等作用于中枢与周围组织器官 [2] [3] [4] ，研究表明PACAP通过受体后信号蛋白激酶C (PKC)介导的一系列反应抑制多巴胺的分泌 [5] ；PACAP还可通过类似于光的方式改变视交叉上核(Suprachiasmatic Nucleus, SCN)的活动节律，暗示PACAP能通过某种途径调节睡眠和觉醒的转换，参与失眠的机制调控 [6] ⁵ 。

酸枣仁汤(Suanzaoren Decoction, SZRD)是传统医学治疗失眠的经典方，其作用机制可能与激活脑皮质内谷氨酸受体的表达 [7] 、调控NG2细胞的功能、NMDA受体的表达 [8] 和中枢神经甾体及其受体的表达有关 [9] 。对氯苯丙胺酸(PCPA)是5-羟色胺(5-HT)合成抑制剂，可致睡眠昼夜节律紊乱，常用来制作大鼠失眠模型 [10] 。PCPA抑制5-HT导致失眠的机制是否与PACAP及其受体后信号有关，目前尚未见报道。本研究选用腹腔注射(ip)PCPA制备大鼠失眠模型，观察其大脑皮质PACAP、PACAP特异性受体(PACAPR1A)及受体后信号PKC活动变化，并使用SZRD干预治疗，进一步探讨失眠的机理，为临床合理用药提供实验依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

SD大鼠，雄性，体重在200 ± 20之间，购于重庆腾信生物科技有限公司(证书编号：SCXK (Jun) 2012-0012)提供。按照实验伦理委员会要求和规定开展动物实验。选择室温20℃~24℃，避免强光照射的环境下适应性喂养1周。

2.2. 试剂与仪器

PCPA (美国Sigama公司，C-6506)；SZRD购于贵阳同仁堂药店；Trizol (Life technologies公司)；分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；7500 RT-PCR仪(美国ABI公司)；cDNA反转录试剂盒(Thermo Scientific公司)；ChemiDocTM XRS + with Image LabTM Software (BIO-RAD)，RT-PCR引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

3. 方法

3.1. 药物制备

SZRD组成药物包括酸枣仁18 g，知母10 g，茯苓10 g，川穹5 g，甘草3 g组成，按量称取10剂，加8倍纯水浸泡，60 min后煎煮，煮沸30 min取滤液，滤渣再加6倍纯水，再煎煮20 min后过滤，将两次滤液混合浓缩至15 g/ml浓度，4℃冰箱保存备用。

PCPA悬浮液：称取PCPA粉末，边加入生理盐水边研磨，配制成2.5 mg/ml浓度的PCPA溶液 [11] ，4℃冰箱保存备用。

3.2. 分组、造模与给药

SD大鼠64只，雄性，随机分成8组，每组8只。分别为7天正常组：不做任何处理；7天对照组：ip生理盐水7天；7天PCPA组：ip PCPA 7天；15天正常组：不做任何处理；15天对照组：ip生理盐水7天，生理盐水连续灌胃8天；15天PCPA组：ip PCPA 7天，生理盐水连续灌胃8天；SZRD组ip 生理盐水7天，SZRD连续灌胃8天；PCPA + SZRD：ip PCPA 7天，SZRD连续灌胃8天。参照已有研究 [1] ，PCPA按0.35 g/kg的体质量、等体积生理盐水予腹腔注射，SZRD按15 g/kg的体质量、等体积生理盐水予灌胃治疗。

3.3. 取材

最后一次给药后，麻醉，冰上取出大脑皮质，分离前额叶，置于−80℃冰箱保存备用。

3.4. 引物的设计

根据NCBI Genebank基因数据库，设计PCPAP基因特异性引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成，见表1。

Table 1. Primer sequences for fluorescence quantitative PCR

表1. 荧光定量PCR引物序列

3.5. 总RNA的提取，cDNA的合成和反应条件

Trizol法提取RNA，按照逆转录试剂盒操作，逆转录cDNA，−20℃保存备用。采用两步法，以GAPDH为内参基因，按照以下反应条件进行40个PCR循环：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，每个基因重复三次。

3.6. 统计学分析

采用2-△△Ct法计算基因相对表达量，采用SSPS 22.0统计软件对数据进行单因素方差分析，用平均值 ± 标准差( $\bar{x}$ ± s)表示，P < 0.05判定差异有统计学意义，P < 0.01为差异具有显著统计学意义。

4. 结果

4.1. PCPA引起大脑皮质PACAP mRNA表达变化及SZRD的干预作用

与7天对照组相比，7天PCPA组大脑皮质PACAP mRNA表达量显著降低(^**P < 0.01，表2)，15天PCPA组大脑皮质PACAP mRNA表达量下降(^*P < 0.05，表2)。与15天PCPA组相比，酸枣仁汤干预后，PCPA + SZRD组大脑皮质PACAP mRNA表达增加(P < 0.05，表2)。

4.2. PCPA引起的大脑皮质PACAP R1A mRNA表达变化及SZRD的干预作用

与7天对照组相比，7天PCPA组大脑皮质PACAP R1A mRNA表达量显著降低(P < 0.01)，15天PCPA 组大脑皮质PACAPR1A mRNA表达量也显著降低(P < 0.01)。SZRD组与15天对照组相比大脑皮质PACAPR1A mRNA表达量显著降低(^*P < 0.05)。与15天PCPA组天相比，酸枣仁汤干预后，PCPA + SZRD组大脑皮质PACAPR1A mRNA表达显著增加(^##P < 0.01)，见表2。

4.3. PCPA引起大脑皮质PKC mRNA表达的变化及SZRD的干预作用

与7天对照组相比，7天PCPA组大脑皮质PKC mRNA表达量降低(^*P < 0.05)，15天PCPA组大脑皮质PKC mRNA表达量显著下降(^**P < 0.01)与15天PCPA组相比，酸枣仁汤干预后，PCPA + SZRD组大脑皮质PKC mRNA表达增加(^#P < 0.05)，见表2。

Table 2. Expression of PACAP, PACAPR1A and PKC mRNA in cerebral cortex of rats in each group ( $\bar{x}\pm s$, n = 8)

表2. 各组大鼠大脑皮质PACAP、PACAPR1A和PKC mRNA表达( $\bar{x}$ ± s, n = 8)

与7天对照组相比，**P < 0.01，*P < 0.05；与15天PCPA组相比，^##P < 0.01，^#P < 0.05。

5. 讨论

失眠的发病机制较为复杂，脑内5-HT含量降低是引发失眠的主要原因，DA含量降低可减少觉醒次数，促进睡眠 [12] 。PCPA能抑制5-HT的合成，导致脑内5-HT含量降低而引起失眠 [13] ，本研究发现当脑内5-HT含量下降后，PACAP、PACAPR1A及PKC mRNA相对表达量都减少，受体后信号蛋白PKC mRNA表达水平降低。

目前PACAP已被证明能够影响神经传递、神经保护、神经调节和免疫抑制等多种生理活动。PACAP可能通过改变大脑皮层、黑质、纹状体和海马等重要脑区的神经细胞死亡或突触可塑性 [14] ，参与认知障碍，而海马突触可塑性是学习记忆形成和巩固的基础，对睡眠稳态具有调节作用 [15] 。研究发现PCPA致大鼠失眠后，大脑皮质Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性显著降低，引起细胞内Ca²⁺浓度上升从而刺激大脑星形胶质细胞(Ast)释放ATP [16] ，且脑内5-HT含量降低后引起大脑皮层PACAP信号系统mRNA表达量的改变，提示PACAP信号参与了脑内5-HT合成障碍导致胶质细胞和能量代谢改变过程，前期的实验发现脑内5-HT含量下降后大鼠Ast被激活，PCPA诱导失眠后大脑皮质ATP水平明显降低，提示星形胶质细胞上可能存在PACAP特异性结合位点，5-HT含量的变化可能与PACAP共同作用于胶质细胞，调节胶质细胞的活动，进而影响皮层的兴奋性。本研究显示PCPA失眠大鼠PACAP mRNA水平降低，而SZRD干预治疗后其水平显著增高，暗示PACAP与失眠症的发病机制及治疗密切相关。

PACAPR1A是PACAP的特异性受体，具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体。PACAPR1A在脑内中枢神经系统分布 [17] ，在皮质和海马体中，PACAPR1A与腺苷酸环化酶结合的功能表达与PACAP的mRNA表达密切相关 [18] 。本结果显示PCPA失眠大鼠PACAPR1A mRNA表达水平降低，具有显著性差异，SZRD干预后其表达水平明显增高，揭示PACAPR1A与睡眠机制及治疗密切相关。

PKC能够促进神经递质的释放和基因表达，影响细胞内信号的传导，还可改变神经细胞神经突触的可塑性，研究表明失眠患者被治疗后PKC的转录水平会显著增高 [19] ，还有研究发现PKC具有抑制DA分泌的作用 [5] 。本研究显示PCPA失眠大鼠PKCmRNA水平显著降低，这可能导致DA分泌量增多，促使失眠的发生。而SZRD的干预作用能使PACAP受体基因表达上调，PACAP1A及PKC mRNA的表达量也明显升高，说明SZRD可通过调节皮层PACAP信号通路活动来调节皮层的兴奋性，提示PACAP信号可能是SZRD干预失眠症的一个潜在靶点。

综上所述，脑内5-HT含量下降使大鼠大脑皮质PACAP、受体PACAPR1A以及受体后信号PKC基因表达下调，PACAP与5-HT的相互作用可能与星型胶质细胞活动相关，PACAP信号可能是SZRD干预失眠症的一个潜在靶点，本研究结果为SZRD临床运用提供了新的理论依据。

基金项目

国家自然科学基金(81760816)。

NOTES

^*通讯作者。