1. 引言
高糖是引发高血糖、糖尿病等疾病的主要病因，从而导致人群逐步趋于肥胖，最终引发人类健康的重大公共卫生危机事件 [1] 。因此，营养专家号召大家减少糖类和脂肪的摄入。甜菊叶(Stevia rebaudiana)，也可称之为甜叶菊，现在被广泛种植 [2] 。甜菊糖苷是一种提取自甜叶菊的零热量新型天然甜味剂，与甜菜糖、甘蔗糖一起被称为“世界三大糖源” [3] 。甜菊叶的糖苷是多种糖苷混合而成的物质，它们均具有相同结构骨架以及苷元甜菊醇，唯一不同之处在于不同的苷键上结合的糖种类和数量 [4] [5] 。甜菊糖苷拥有高甜度和低热量的特性，它的甜度大约是300倍蔗糖甜度，但它的热量却只为蔗糖的1/300 [6] 。甜菊糖苷具有降血糖、降血压、抑菌抗炎、提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤等功效 [7] 。燕麦(Arena sativa)，一种典型的禾本科植物，又被称为莜麦、雀麦，主要类型有：带稃型(皮燕麦)和裸粒型(裸燕麦)。燕麦在世界各地被广泛种植，也是一种在中国具有2100多年历史的主要杂粮作物 [8] 。燕麦是低糖、高营养、高能量的食品 [9] 。燕麦中富含多种功能性成分，主要包括：可溶性β-葡聚糖、蛋白质、钙、矿物质、生物碱、燕麦皂苷等 [10] ，在这些物质中，β-葡聚糖被公认是一种具有降脂作用的物质 [11] ，能够改善肠道菌群，对抗疲劳、降糖、降脂、预防结肠癌、增强机体免疫力具有重大作用 [12] 。
近几年，酸奶在全球范围内发展迅速，受到广大消费者的喜爱，产品种类越来越多，销售量也越来越大。酸奶具有丰富的保健功能，其中包括解酒、抗氧化、减肥、减轻乳糖不耐受、通便、对砷毒性的缓解作用、富含锌以及清热解毒等功效 [13] 。此外，酸奶还具有减少胆固醇的吸收、调节肠道菌群、促进胃肠蠕动、增强人体免疫力、容易被消化吸收、改善肠道健康等作用 [14] [15] 。由于在制作加工全脂酸奶时，一般加入了7%~10%的蔗糖，所以它不但会给人体带来更多的热量，而且还会引发牙齿的龋齿 [16] 。试验以新型甜味剂甜菊糖苷和木糖醇来取代蔗糖，并采用脱脂灭菌牛奶作为原料乳，加入燕麦谷物，确定最优生产工艺配方，以期进一步研制一种健康减糖降脂型酸奶，拓宽酸奶市场。
2. 材料与设备
脱脂灭菌纯牛奶(青岛新希望琴牌乳业有限公司)；型号为YO-MIX PRIME 900 LY0 200 DCU复合菌种，成分为嗜热链球菌种和德氏乳杆菌保加利亚亚种(丹尼斯克中国有限公司)；燕麦麸皮粉(张家口华盛粮油加工有限公司)；木糖醇(安徽蜀健药业有限公司)；甜菊糖苷(曲阜制药有限公司)。
LPH-250F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C雷磁pH计，上海精密科学仪器有限公司。
3. 试验方法
研究的试验方法主要包括工艺流程和单因素实验设计，具体内容如下。
3.1. 工艺流程
工艺流程包括制作工艺和操作要点，具体内容如下。
3.1.1. 制作工艺
甜菊糖苷、木糖醇
↓
(1) 脱脂灭菌牛奶→预热(40℃~50℃)→混合搅拌→冷却→接种(42℃)→发酵→冷藏→后熟
(2) 燕麦麸皮粉
(1) + (2)→调配搅匀→成品
3.1.2. 操作要点
1) 称量：量取100 mL纯牛奶置于150 mL锥形瓶中，分别称量一定量的复配乳酸菌种，木糖醇和甜菊糖苷。
2) 预热：把牛奶放置于万用电炉上加热至45℃~50℃。
3) 调配：将一定量的木糖醇、甜菊糖苷按一定比例混合，跟预热好的牛奶充分搅拌混合均匀。
4) 冷却：混合均匀的物料冷却至约42℃，用灭菌的温度计测量其温度。
5) 接种：在无菌环境下，按照配方加入发酵剂并搅拌溶解。先取少量牛奶溶解复合乳酸菌发酵剂。需要注意容器需充分灭菌，防止存在其它非需要菌群污染。灌装封口：将上步骤中接种完成后的牛奶灌装到经过消毒的玻璃容器剩余牛奶中，用密封性良好的保鲜膜对锥形瓶进行密封。灌装量为90%，不可过量。
6) 发酵：将灌装封口好的牛奶放入固定温度的恒温发酵箱中发酵，使酸奶达到凝固状态。
7) 冷藏后熟：把发酵完成的酸奶放进4℃的冰箱中进行冷藏，在低温状态下，对乳酸菌的生长进行快速有效的抑制，降低其酶活性，避免过量产酸；同时还可以提高酸奶的质量，使酸奶变得清爽可口。后熟可以改善酸奶的口感和硬度，促进产生香味物质，提高酸奶风味。香味物质产生的最大释放时间一般是在制成后4个小时左右，通常在12~24小时完成。
8) 燕麦调配：冷藏后熟完毕的酸奶加入燕麦麸皮粉，充分搅拌均匀即可食用。
3.2. 单因素试验设计
单因素试验设计包括发酵时间对酸奶品质的影响、发酵菌种添加量对酸奶品质的影响和甜菊糖苷替代比例对酸奶品质的影响，具体内容如下。
3.2.1. 发酵时间对酸奶品质的影响
在发酵时间单因素实验中，固定脱脂灭菌牛奶添加量100 mL，参照杨洋 [17] 和张蕴哲等 [18] 控制总糖量为8%，其中木糖醇添加量为总糖量的50%，甜菊糖苷为总糖量的50%，0.036%菌种接种量，在42℃时分别发酵4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，于4℃冰箱中冷藏18 h，最后加入3%的燕麦麸皮粉进行调配搅拌，通过感官评价来判断酸奶的最佳发酵时间。
3.2.2. 发酵菌种添加量对酸奶品质的影响
在发酵菌种添加量单因素实验中，固定脱脂灭菌牛奶添加量100 mL，总糖量为8%，其中木糖醇添加量为总糖量的50%，甜菊糖苷为总糖量的50%，分别添加发酵菌种添加量0.032%、0.034%、0.036%、0.038%、0.040%，在42℃时发酵6 h，于4℃冰箱中冷藏18 h，最后加入3%的燕麦麸皮粉进行调配搅拌，通过感官评价来判断酸奶的最佳发酵菌种添加量。
3.2.3. 甜菊糖苷替代比例对酸奶品质的影响
在甜菊糖苷替代比例单因素实验中，固定脱脂灭菌牛奶添加量100 mL，总糖量为8%，再分别加入木糖醇添加量为总糖量的80%、70%、60%、50%、40%，甜菊糖苷为总糖量的20%、30%、40%、50%、60%，再添加0.036%复合乳酸菌种，在42℃时发酵6 h，于4℃冰箱中冷藏18 h，最后加入3%的燕麦麸皮粉进行调配搅拌，通过感官评价来判断酸奶的最佳甜菊糖苷替代比例。
3.3. 响应面优化试验设计
由于燕麦麸皮粉仅作为辅料在酸奶发酵结束后添加进行调配搅拌，对酸奶发酵影响较小，因此不作为考察因素。参照于楠楠等 [19] 和王丽爽等 [20] 的研究试验，最终确定燕麦麸皮粉添加量为3%。在单因素试验的基础上，运用Box-Behnken中心组合设计原理，将发酵时间、发酵菌种添加量、甜菊糖苷替代比例作为考察因素(X)，将低脂发酵酸奶感官评分(Y)作为响应值，运用Design Expert 13软件进行3因素3水平的响应曲面优化，构建数学模型，以期得到甜菊糖苷低脂燕麦酸奶的最佳发酵工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。
Table 1. Factors and levels of response surface experiment for yogurt formula optimization
表1. 酸奶配方优化响应面试验因素与水平
3.4. 指标测定
指标测定包括产品ph的测定、酸奶持水力测定、酸奶乳清析出率的测定和感官评定标准，具体内容如下。
3.4.1. 产品pH的测定
用雷磁pH计测量产品的pH值。
3.4.2. 酸奶持水力测定
用量勺取出5 mL酸奶样品，用电子天平称量其重量，按照操作说明书，开启离心机，设置转速3000 r/min以及离心时间10 min，离心机结束工作后，拿出离心管，轻放置于台面10 min。倒除上层清液后，称量其质量，酸奶持水力按式(1)计算。
式(1)
式中：m代表残余物的质量，g；
m0代表样品的质量，g。
3.4.3. 酸奶乳清析出率的测定
用量勺取出5 mL酸奶样品放入离心管中，用电子天平称量其重量，设置离心机转速3000 r/min，离心时间10 min，完成后将离心管静置台面10 min后，吸取上清液后称量其重量，酸奶乳清析出率按式(2)计算。
式(2)
式中：m1代表上清液质量，g；m0代表样品的质量，g。
3.4.4. 感官评定标准
本实验中甜菊糖苷低脂燕麦酸奶的感官评价采用评分检验法 [21] [22] 。按照GB 19302-2010酸牛乳感官评鉴细则中对评分人员要求的规定，选用10名专业人员组成感官评价小组，评分人员以甜菊糖苷低脂燕麦酸奶的组织状态、色泽、口感、风味4个方面为依据，对其进行评价，总分100分，按照表2的评分标准对产品打分，得出分数中按式(3)计算。
Table 2. Sensory evaluation standard of low-fat oat yogurt
表2. 低脂型燕麦酸奶感官评定评分标准
3.5. 数据统计分析
采用Excel 2016和SPSS 22.0对实验数据进行数据处理及统计分析整理，使用和Origin 2018作图，利用Design-Expert 13进行响应面分析，所有试验数据都是3次平行实验结果的平均值，数据表示为(
± SD)形式。
4. 实验结果与讨论
实验结果分析包括单因素实验结果与分析和响应面优化结果分析，具体内容如下。
4.1. 单因素试验结果与分析
选取发酵时间、发酵菌种添加量和甜菊糖苷替代比例3个因素进行单因素试验，研究不同的因素对低脂燕麦酸奶感官评分的影响。
4.1.1. 发酵时间对酸奶品质的影响
在酸奶发酵的过程中，微生物会持续不断地产酸、产香，对酸奶最终的组织状态、风味影响挺大。由图1可以看出，酸奶的感官评分变化趋势随着其发酵时间的不断延长表现为先升后降的趋势变化。低脂燕麦酸奶的感官评分在发酵时间6 h时达到最高分(86.75 ± 0.46)分，且析出乳清最少，其组织形态最佳。在发酵时间低于6 h时，由于发酵时间不充足，发酵不完全，酸奶的质地较为稀释，且酸奶香味不够浓郁，口感整体偏涩；随着发酵时间的延长，酸奶的凝固性逐渐增加，最终呈半固态状，并伴有少量乳清；同时，发酵时间越长，其酸度整体会变弱，但超过6 h时，酸奶会析出较多乳清，其整体组织结构越来越差。因此，6 h是最佳的发酵时间。
Figure 1. Influence of fermentation time on yogurt quality
图1. 发酵时间对酸奶品质影响
4.1.2. 发酵菌种添加量对酸奶品质的影响
由图2可以看出，随着复合乳酸菌种添加量的增加，低脂燕麦酸奶品质的感官评分先增高后降低。当发酵菌种用量较少时，在整个发酵过程中，酸奶的组织结构较差，产酸能力不强，酸度降低。当菌种添加量为0.036%时，可以形成有强烈酸奶风味，无乳清析出，口感细腻爽滑，不会出现分层现象，黏稠性好。但当发酵剂添加量大于0.036%时，口感偏酸，过于黏稠，有乳清析出。故最佳发酵菌种添加量为0.036%。
Figure 2. Influence of fermentation strain addition amount on yogurt quality
图2. 发酵菌种添加量对酸奶品质的影响
4.1.3. 甜菊糖苷替代比例对酸奶品质的影响
由图3可知，当甜菊糖苷替代比例在20%~30%之间时，随着替代比例的增加，酸奶感官评分随之快速升高；在甜菊糖苷替代比为30%时评分达到最大值，为(88.60 ± 0.32)分；替代比例达到30%之后感官评分开始逐步下降。感官评分升高的原因可能是添加了甜菊糖苷增强了酸奶的风味和结构 [23] ；感官评分下降是因为当甜菊糖苷替代比例达到一定值后，甜菊糖苷带有的淡淡薄荷醇的苦味和涩味 [24] 就会比较突出，同时还会产生后甜味，使得酸奶风味不佳，成品的组织状态也会变差，影响酸奶感官品质。故而甜菊糖苷最佳替代比例为30%。
Figure 3. Influence of stevia substitution ratio on yogurt quality
图3. 甜菊糖苷替代比例对酸奶品质影响
4.2. 响应面优化结果分析
响应面优化结果分析包括响应面试验设计和结果、回归模型分析、响应面交互作用分析、最优配方的确定和验证试验，具体内容如下。
4.2.1. 响应面试验设计和结果
在单因素试验的基础上，固定燕麦麸皮粉添加量3%，总糖量8%，以发酵时间、发酵菌种添加量、甜菊糖苷替代比例为考察因素自变量(X)，低脂燕麦酸奶感官评分(Y)为响应值，运用Box-Behnken中心组合设计，研究三个因素之间的交互作用对产品品质的影响，响应面试验结果如表3所示。
Table 3. Response surface test design and results
表3. 响应面试验设计和结果
4.2.2. 回归模型分析
运用Design-Expert 13软件，对表4的数据展开方差与显著性分析，其结果见表5。对此模型进行分析，P值为0.0007，小于0.05，说明回归模型具有显著性；失拟项的P值为0.0678大于0.05，不显著，表明该模型符合实际情况，说明对低脂型燕麦酸奶工艺条件的预测是合理可行的，即在整个试验过程中不确定、不可控的因素对试验结果影响是比较小的，方程对试验有较好的拟合性。该模型的相关系数R2 = 0.9530，表明Y的变化有95.30%与A、B、C三个因素有关，该模型的拟合程度好，所产生的试验误差小，可以用于低脂燕麦酸奶工艺条件的优化。另外，从分析结果可以看出，A2为极显著，B、B2为显著，A、C、AB、AC、BC交互作用不显著。
根据表4的F值可知，影响低脂燕麦酸奶品质的因素主次顺序为B > C > A，即发酵菌种添加量 > 甜菊糖苷替代比例 > 发酵时间，即发酵菌种添加量对酸奶品质感官评分的影响最为显著。
对数据进行多项拟合，得到回归方程：感官得分Y = 88.42 + 0.2963A − 0.7875B − 0.4588C + 0.6575AB − 0.81AC + 0.4175BC − 4.02A2 − 1.99B2 − 1.96C2。
Table 4. Analysis of variance of response surface test regression equation
表4. 响应面实验回归方程的方差分析
注：P ≤ 0.0001，表示高度显著，用“***”表示；P ≤ 0.01，表示极显著，用“**”表示；P ≤ 0.05，表示显著，用“*”表示；P > 0.05，表示不显著。
4.2.3. 响应面交互作用分析
运用Design-Expert 13进行分析，得到低脂燕麦酸奶响应面分析图，图4~6是交互因素对响应面值的响应曲面及等高线图。
发酵时间和发酵菌种添加量的交互作用见图4。由图可以看出低脂燕麦酸奶的感官评分随着发酵时间和发酵菌种添加量的增多先上升后下降，响应面等高线图接近于圆形，说明发酵时间和发酵菌种添加量的交互作用不太显著。发酵菌种添加量的变化趋势快于发酵时间，说明发酵菌种添加量比发酵时间对酸奶感官评分的影响更为显著。
(a) 
(b)
Figure 4. The three-dimensional surface diagram and contour map of the effect of the fermentation time and fermentation bacteria addition on sensory evaluation of yoghurt
图4. 发酵时间和发酵菌种添加量对酸奶感官评价影响的三维曲面图和等高线图
发酵时间和甜菊糖苷替代比例的交互作用见图5。由图可以看出低脂燕麦酸奶的感官评分随着发酵时间和甜菊糖苷替代比例的提高先增后减，等高线图偏向于圆形，表示发酵时间和甜菊糖苷替代比例的交互作用不显著。等高线沿甜菊糖苷替代比例轴向发酵时间轴密集，说明甜菊糖苷替代比例比发酵时间对于酸奶的感官评分影响更加显著。响应值有最大值，表示因素AC之间存在一定交互作用，但是对感官品质具有相对较小的影响。
(a) 
(b)
Figure 5. Three dimensional surface graph and Contour line graph of the effect of fermentation time and stevioside substitution ratio on the sensory evaluation of yogurt
图5. 发酵时间和甜菊糖苷替代比例对酸奶感官评价影响的三维曲面图和等高线图
发酵菌种添加量和甜菊糖苷替代比例的交互作用见图6。由图可以看出低脂燕麦酸奶的感官评分随着发酵菌种添加量和甜菊糖苷替代比例的提高先变高后变低，等高线图呈圆形，说明发酵菌种添加量和甜菊糖苷替代比例的交互作用不显著。总的来说，感官评分的趋势变化不大。图6所示的结果与表5所显示的结果一致。
(a) 
(b)
Figure 6. Three-dimensional surface and contour maps of effects of fermentation strain addition and stevia substitution ratio on sensory evaluation of yogurt
图6. 发酵菌种添加量和果甜菊糖苷替代比例对酸奶感官评价影响的三维曲面图和等高线图
4.2.4. 最优配方的确定
利用Design-Expert 13软件进行回归模型预测低脂燕麦酸奶的最佳工艺条件为：发酵时间为6.035 h，发酵菌种添加量为0.036%，甜菊糖苷替代比例为28.541%，感官评分为88.538分。根据实际情况以及方便操作，将最佳工艺条件参数调整修订为：发酵时间为6 h，发酵菌种添加量为0.036%，甜菊糖苷替代比例为28.5%。
4.2.5. 验证试验
由表5可知，在该工艺条件下进行验证试验，做三次独立性试验，对低脂燕麦酸奶的品质进行验证，3次试验的感官评分平均值为(88.74 ± 0.46)分，跟响应面预测的88.54分极其接近，说明本试验中得到的酸奶制作工艺是可靠的。
Table 5. Optimize process validation results
表5. 优化工艺验证结果
5. 产品质量检验
产品质量检验包括低脂燕麦酸奶感官指标和理化指标，具体内容如下。
5.1. 低脂燕麦酸奶感官指标
这种低脂燕麦酸奶是呈现一种微黄色或者乳白色，色泽一致均匀，外表平滑，部分存在着乳清分离的情形，具备着独特的口感，具有燕麦的香气。口感较为细腻、酸甜可口。
5.2. 理化指标
在此工艺条件下制备的低脂燕麦酸奶持水性较好，乳清析出率最低，pH值的范围在4.3~4.5之间浮动。
6. 结论
采用单因素试验和响应面优化设计试验来确定低脂燕麦酸奶最佳生产工艺条件：发酵菌种的添加量为0.036%，甜菊糖苷替代比例为28.5%，发酵时间为6 h，发酵温度为42℃，最终的感官评分为(88.74 ± 0.46)分，与模型预测值88.54分接近。在最优的工艺条件下，最后制备而成的低脂燕麦酸奶结构组织一致均匀、没有明显乳清物料分层的现象、风味独特良好、口感爽滑细腻、有独特的燕麦风味和香气。本产品既满足大众对低脂低热量的健康追求，也可为燕麦应用于食品的开发利用提供参考，从而进一步拓宽酸奶市场。
NOTES
*通讯作者。