1. 引言
中国林蛙是我国东北地区长白山麓的特有品种，也是吉林省特色资源珍贵蛙种，资源丰富。林蛙输卵管是我国传统名贵滋补中药哈士蟆油，也称哈蟆油、林蛙油，具有养肺滋肾的功效。林蛙的蛙卵也称哈蟆籽，含有人体必需的氨基酸、微量元素、多不饱和脂肪酸、磷酯和雌激素等成分，具有很高的营养价值，在民间被公认为是与林蛙输卵管并列的滋补佳品。林蛙卵具有调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防妇女更年期综合症的作用 [1] 。对林蛙卵的营养成分和营养价值全面系统分析结果表明，林蛙卵中蛋白质的含量为16.80 g/100 g比鸡蛋中的11.80 g/100 g蛋白质含量略高一些，说明林蛙卵的营养价值比较高 [2] 。而采用乙醇溶剂或CO2超临界萃取等技术提取得到的林蛙卵脂溶性物质，俗称林蛙卵油，近年来被认为具有降脂、抗焦虑和妇科保健等活性。目前已有相关报道表明，林蛙卵油还具有镇静和抗焦虑作用 [3] 。另有资料显示，林蛙卵油对红细胞SOD的活性有促进作用 [4] 。此外林蛙卵油中含有很高的对人体细胞免疫系统有改善作用的免疫因子，其含有的孕酮和雌二醇是天然生成的调理激素，可以促进钙的吸收，调节人体内分泌，促进身体的生长发育。将其加工提取后用于美容保健化妆品中，可有效治疗痤疮、褐斑，防止皮肤粗糙，保持皮肤光泽与弹性 [5] 。
然而，林蛙卵和林蛙卵油由于其本身具有较强的鱼腥味和较深的颜色，口感与色泽不佳，只能通过做成软胶囊等制剂掩盖，大大限制了它的广泛应用。而目前对林蛙卵油所采用的树脂吸附法精制和分子蒸馏精制的脱腥除味工艺，存在着溶剂残留，回收率较低，浪费严重，成本成倍增加等缺点 [6] 。本文通过研究林蛙卵油脱腥脱色提取精制生产工艺方法，以精制林蛙卵油为原料进行系列保健和美容产品研发。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
供试材料为中国林蛙，取输卵管后的副产品林蛙卵，干燥保存。
主要试验材料见表1。
2.2. 仪器
使用仪器见表2。
3. 试验方法
3.1. 林蛙卵粗油制备
将林蛙卵去掉残留筋膜，干燥(80℃干燥箱24 h，含水量不超过8%)。采用索式提取的方法提取林蛙卵：石油醚(60~90℃)为4个虹吸体积，提取时间为4 h，回收率为22.7%。
3.2. 脱腥脱色
分别称取林蛙卵粗油5 mL于9个小烧杯中，将1、2和3号样品加热至60℃、80℃、100℃后恒温20 min，再分别加入250 µL (油体积的5%) 30%过氧化氢水溶液(用NaOH溶液调节pH至9.0，现配现用)反应时间40 min；将4、5和6号样品分别升高温度至60℃、80℃、100℃后恒温20 min，再分别加入400 µL (油体积的8%) 30%过氧化氢水溶液(pH 9.0)反应时间40 min；将7、8和9号样品分别升高温度至60℃、80℃、100℃后恒温20 min，再分别加入500 µL (油体积的10%) 30%过氧化氢水溶液(pH 9.0)反应时间40 min。
然后用温的去离子水分别洗涤以上处理后的9个样品三次，以去除残余的过氧化氢，每次用水量为油体积的10%，于60℃的干燥箱中静置6小时以上。
3.3. 透光度的测定
林蛙卵粗油去色前后的吸光度计算去色率，检测波长为420 nm，以正己烷作参比。去色率(%) = (A0 − A1)/A0 × 100%。式中，A0为原油的吸光度，A1为去色后油脂的吸光度。
3.4. 过氧化值残留量的测定
样品中过氧化值残留量的检测采用动植物油脂过氧化值(GB/T5538-2005)的测定方法，具体步骤参照GB/T5538-2005。
3.5. 成分分析
① 脂肪酸检测色谱条件 [7]
色谱条件：色谱柱Agilent 19091G-133细管柱；柱前压10.36 psi；柱温90℃~290℃，按10℃/min程序升温；进样口温度280℃，载气He。
质谱条件：质量分析器为四极滤质器；El源；离子源温度230℃ ；质量扫描范围50~700 amu；溶剂延迟3 min。
② 孕酮检测色谱条件 [8]
色谱柱：C18柱(250 × 4.6 mm, 5.5 µm)；流动相：乙腈：水(体积比为40:60)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 µL；检测波长：240 nm。
③ 磷脂检测色谱条件 [9]
色谱柱：C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 µm)，以甲醇为流动相，柱温为室温，流速为1.0 mL/min，进样量为10 µL；蒸发光散射检测器参数：载气为空气，载气压力为250 kPa，载气流量为2.2 L/min，漂移管温度为75℃。
4. 结果与讨论
4.1. 林蛙油脱腥去色
林蛙卵粗油有刺鼻的腥臭味，经过过氧化氢处理后的精炼油腥味明显减小，且颜色明显变浅，由深棕色(图4)变为浅黄色(图5)。
应用不同条件对林蛙卵粗油精炼后颜色有不同程度的明显改变(图1)，实验结果表明处理4、5、8和9号样品的去色率均在70%以上(图2)，但是8和9号样品的过氧化氢残留量相对较高(图3)，这可能是由于过氧化氢的用量过高。
林蛙卵粗油精炼后的回收率差别不大，基本都在60%以上，损失主要在于水洗的过程中发生乳化现象，水洗次数越多，回收率越小，但水洗次数越少，过氧化氢残留量也会随之增大。
通过对比表明(表3)使用处理4和5号的条件，即将林蛙卵粗油在温度60~80℃，与30%过氧化氢(添加量为粗油体积的8%)反应40 min，对林蛙卵粗油进行脱腥去色效果最好。
Figure 1. Color contrast of samples before and after treatment
图1. 处理前后各样品颜色对比
Figure 2. Effect of temperature and concentration on color removal rate
图2. 温度、浓度对去色率的影响
Figure 3. The influence of temperature and concentration on the residual quantity
图3. 温度、浓度对残留量的影响
Table 3. Deodorization and color removal of Rana temporaria chensinensis David egg oil under different conditions
表3. 不同条件对林蛙油脱腥去色结果
4.2. 林蛙卵粗油与精炼油的成分对比分析
① 脂肪酸
采用气相色谱–质谱联用(GC-MS)法对林蛙卵粗油与精炼油进行脂肪酸的检测，前者检测出28种脂肪酸，后者为20种(表4)。
林蛙卵粗油与精炼油的主要成分均为棕榈酸和反-9-十八碳烯酸，其中常见及对人体有益的脂肪酸如：棕榈酸(润滑剂、软化剂)、硬脂酸(稳定剂、表面活性剂、橡胶硫化促进剂、防水剂、抛光剂、金属皂)亚油酸(降低人体血液中胆固醇和血脂)、亚麻酸(可调节血脂，预防心肌梗塞和脑梗塞、降血压、减肥、抑制过敏反应、抗炎作用、保护视力、增强智力、抑制衰老)花生四烯酸(对提高智力和增强视敏度具有重要作用，并具有酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性，对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效)。二十碳五烯酸(对治疗冠状动脉心脏病、高血压和炎症等有效)林蛙卵粗油与精炼油中均可检测到，且含量变化不大。二十二碳五烯酸(具有调节血脂、软化血管，降低血液粘度，改善视力、促进生长发育和提高人体免疫功能等作用，其调节血脂的功能比有血管清道夫之称的EPA还要强很多倍。更适合于血脂偏高的中老年人)在精炼油中未检测到，但相关文献显示诸如n-3、n-6系列必须脂肪酸在人体内可相互转化。反亚油酸味道对人皮肤有刺激作用，摄入可引起恶心和呕吐并且 对环境、水体和大气可造成污染，精炼油中未检测到反亚油酸的存在，这可能是林蛙卵粗油精炼后腥味减小的原因之一；二十二碳六烯酸(DHA)是人的大脑发育、成长的重要物质之一，能优化胎儿大脑锥体细胞的磷脂的构成成分，降低血脂肪、预防心脏血管疾病，改善老人痴呆，精炼油中二十二碳六烯酸含量有所增加。
脂肪酸为林蛙卵粗油的主要成分，在精炼后的林蛙卵粗油中缺少了一些相对含量较低的饱和脂肪酸，如13-甲基十四烷酸、14-甲基十五烷酸等，可能是因为其相对含量较少，在精炼过程中损耗了。而其含有的n-3、n-6系列必须脂肪酸并未减少，故精炼后的林蛙卵油其脂肪酸功用差异并未有所改变。
Table 4. Comparison of fatty acid content in crude oil and refined oil of Rana temporaria chensinensis David egg oil
表4. 林蛙卵粗油与精炼油中脂肪酸含量对比
② 孕酮
采用高效液相色谱(HPLC)法对林蛙卵粗油与精炼油进行孕酮含量的检测，林蛙卵粗油孕酮含量为136 μg/g，精炼油孕酮含量为318 μg/g。孕酮又名黄体酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著形态学影响，为维持妊娠所必需，可以抑制宫缩，维持蜕膜反应，抑制免疫反应。精炼后的林蛙卵油中孕酮含量有所增加，可能是由于林蛙卵粗油中的某种或某些化合物质经过高温与过氧化氢反应生产了孕酮，故精炼后的林蛙卵油在孕酮的功用上要略高于林蛙卵粗油。
③ 磷脂
采用高效液相色谱–蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法，磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血性磷脂酰胆碱(LPC)和以磷脂酰胆碱(PC)为标准品，检测林蛙卵粗油与精炼油中磷脂种类及其含量变化。林蛙卵粗油中PE、LPC与PC含量分别为0.194 µg/mL (占卵油总体积3.78%)、0.864 µg/mL (16.9%)、0.215 µg/mL (4.2%)。精炼油中PE、LPC与PC含量分别为0.166 µg/mL (占卵油总体积3.24%)、0.702 µg/mL (12.6%)、0.175 µg/mL (3.1%)。精炼后的林蛙卵油中PE、LPC与PC含量略少于林蛙卵粗油，可能是由于精炼过程中林蛙粗油在高温与空气中进行，使得油脂内的磷脂类成分氧化变性所导致的，故精炼后的林蛙卵油在磷脂的功用上要略低于林蛙卵粗油。
实验结果表面林蛙卵粗油在温度60~80℃，与30%过氧化氢(添加量为粗油体积的8%)反应40 min之后的精制油，色泽及气味均有改善；在孕酮的含量上精制后的油是粗油的2.3倍，脂肪酸及磷脂含量差异较小。该方法可用于林蛙卵粗油的精制。
基金项目
吉林省科技发展计划项目资助(编号：20190304079YY)。
NOTES
*通讯作者。