1. 引言
由马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)引起的病毒病是烟草生产过程中所面临的最严重的病害之一，严重影响烤烟的产量和质量 [1] [2] [3] 。目前，烟草病毒病造成的经济损失已大大超过了烟草真菌性病害 [4] [5] 。在烤烟生产过程中防治马铃薯Y病毒的方法主要以化学农药防控为主，但这种方法不仅防治效果不佳，还会造成农药残留以及环境污染等问题 [6] 。除此之外，近年来通过培育抗病品种来避免病毒病的发生，虽然能有效预防马铃薯Y病毒的发生，但育种周期长，新品种审定缓慢，烟农对新品种特性不明确，从而导致一系列的问题，使该方法难以在短时间内得到推广 [7] [8] [9] 。
已有研究发现，一些生物试剂能够诱导植物对病毒危害产生抗性，植株经诱导后，在面临病原入侵时，仅在侵染部位产生病斑而不会扩散至整个植株，这种植物自身保护性坏死被称为过敏反应(Hypersensitive Reaction, HR) [10] 。HR反应产生的信号分子通过植物韧皮部传至整个植株，从而使植株产生持续抵御多种病原侵染的能力 [11] ，这就是植物的系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance, SAR)。SAR具有广谱性并且能诱导病程相关基因(PR基因)及蛋白(PR蛋白)的表达，已有研究表明，β-罗勒烯能激发植物产生获得抗性(SAR) [12] 。
β-罗勒烯是一种能诱导植物产生防御反应的植物通讯信号分子。已有研究报道，β-罗勒烯能够解除植株水杨酸(Salicylic Acid, SA)途径与茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)途径之间的拮抗，诱导抗性基因PR1基因以及PDF1.2基因表达量同时上升，并改变次生代谢物图谱 [13] 。以上研究均表明，β-罗勒烯在防控马铃薯Y病毒上有着巨大潜力，现以β-罗勒烯为试剂研究其对马铃薯Y病毒的防控效果，为马铃薯Y病毒病的防控提供新思路。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
烤烟品种：“云烟87”(湖南农业大学农学院烟草科学重点实验室馈赠)。采用漂浮育苗的方法育苗，待烟苗长至两叶一心时挑选长势一致且未受胁迫的烟苗移栽至直径10 cm、深度为15 cm的钵子中，长至五叶一心后待用。
β-罗勒烯：购自西格玛公司；10 L干燥罐；玻片；总RNA试剂盒(普洛麦格)，反转录试剂盒(ThermoFisher Scientific, Shanghai)、Luminaris Color HiGreen High ROX Qpcr Master Mix (ThermoFisher Scientific, Beijing)。
化学农药：盐酸吗啉呱(有效成分含量30%)。
试验地点：湖南农业大学作物代谢调控与代谢工程实验室，长沙市浏阳烟草试验基地(经度：113.85˚，纬度：28.29˚)。
试验时间：2022.07~2023.08。
2.2. 试验设计
该试验由两个部分组成，分别为室内盆栽试验及大田试验。其中，室内盆栽试验设置了两个处理，每个处理设置3个重复，每个重复3株烟。分别以经β-罗勒烯诱导的烤烟作为处理组，未经β-罗勒烯诱导的烤烟作为对照，对照除未经β-罗勒烯诱导外，其他操作条件均与处理组一致。大田试验设置了三个处理，分别以施用β-罗勒烯的田块作为处理组，未施用β-罗勒烯及化学农药的田块作为对照组，施用化学农药的田块作为化学农药组，各组别均采用五点取样的方式进行病害调查，每个点随机调查50株烤烟。各个处理之间用黑色薄膜阻隔，且间隔5 m避免相互影响。为了进一步探究β-罗勒烯对PVY的控制效果，本试验挑选了一块面积为1亩、PVY大面积爆发的烟田作为试验地，初次调查时发现该田块PVY的发病率达到了30.5%。现将该烟田平均分为三个部分，分别作为对照组(不施加β-罗勒烯以及化学农药)、β-罗勒烯处理组以及化学农药防控组。处理前采用五点取样的方式，每个点随机调查50株烤烟，分别调查三个处理田块PVY的发病率及病情指数。随后对三部分田块进行相应的处理，15天后再次采用五点取样的调查的方式，每个点随机调查50株烤烟，对三部分田块PVY的发病率以及病情指数进行统计。观察不同处理前后两次调查，分析PVY的发病率及病情指数的变化差异。
2.3. 调查内容及方法
在室内培育烟苗待其长至五叶一心时挑选长势一致健壮且未受胁迫的烟苗用于室内试验，经β-罗勒烯诱导处理后分别在处理组及对照组烟株上接种PVY病毒，接种量及接种部位、接种面积均一致，每个处理设置3个重复。待烟株发病后统计不同处理的发病率及病情指数，并通过分子水平检测不同处理病毒量。进一步进行大田实验，于移栽后15天开始对各处理烟田施加罗勒烯和化学农药，间隔两周。待烤烟长至旺长期及初花期时对各处理分别进行一次PVY发病率及病情指数的调查，调查时均采用五点取样的方式进行统计，每个点调查50株烤烟。除此之外，对已出现马铃薯Y病毒的田块施用β-罗勒烯及化学农药，分析不同处理对病毒病的蔓延及传播是否有抑制作用，处理前后各组别均采用五点取样的方式进行调查，每个点随机抽取50株烤烟。对发病指标进行调查时，参照国家标准GB/T 23222-2008评估病害等级。
病毒病病情指数及发病率计算公式如下：
(1)
(2)
(3)
(4)
3. 结果与分析
3.1. β-罗勒烯诱导烟株防御马铃薯Y病毒病
如图1所示，外源施加β-罗勒烯能够诱导烤烟植株对PVY产生抗性，接种PVY后，经罗勒烯处理的烟株发病情况显著低于对照组，对照组植株生长发育严重受阻，植株大小与处理组相比下降了1/3~1/2。如表1所示，具体表现为：对照组发病率为76.9%，处理组发病率仅为25.3%，处理组发病率下降了51.6%，下降率达到67.10%；对照组烟株病情指数为62.96，处理组烟株病情指数为18.51，病情指数下降了44.45，下降率达到70.60%。
(A)(B)注：(A)：对照(CK)；(B)：β-罗勒烯处理。
Figure 1. Effect of indoor prevention and control of PVY in β-ocimene
图1. β-罗勒烯室内防治PVY的效果
Table 1. Prevention and control effect of β-ocimene on PVY
表1. β-罗勒烯对PVY的防控效果
注：不同处理对应的各项数值中不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
如图2所示，外源施加β-罗勒烯能够显著减轻PVY在植株叶脉上的传播和积累，具体表现为，处理组烟株在接种PVY病毒10天后叶脉开始变黑，叶脉组织坏死，而处理组烟株没有出现叶脉坏死的情况。据统计对照组叶脉坏死的叶片达到7片，而处理组烟株则没有出现叶脉坏死的情况。综上所述，β-罗勒烯对PVY在烟株上的积累与传播具有显著的控制作用，经罗勒烯诱导处理后，烟株对PVY展现出了极强的抗性。根据室内盆栽试验得出的结论进行分析得出，β-罗勒烯作为一种植物通讯信号分子，其能诱导烟株对PVY产生抗性，就此分析罗勒烯完全能够作为一种防控马铃薯Y病毒病的新型试剂用于烤烟大田生产当中。
(A) (B)注：(A)：对照(CK)；(B)：β-罗勒烯处理。
Figure 2. Influence of β-ocimene induced treatment on the accumulation of PVY in tobacco plants
图2. 经β-罗勒烯诱导处理后对PVY在烟株上积累情况的影响
进一步通过分子水平检测不同处理烤烟植株中PVY的含量，结果如图3所示，经β-罗勒烯诱导后，处理组烤烟植株中PVY含量显著低于对照组植株，病毒在处理组植株中的复制被显著抑制，对照组烟株PVY含量相比于处理组升高了近2.7倍。因此，可以进一步得出结论，β-罗勒烯可以诱导烟株增强自身抵御PVY的能力，通过降低烟株内PVY的含量，减轻PVY对烤烟自身的危害。
注：图中不同处理图注上不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
Figure 3. Influence of β-ocimene on the accumulation of PVY
图3. β-罗勒烯对PVY积累量的影响
3.2. 大田施用β-罗勒烯对马铃薯Y病毒病的防治效果
大田试验结果如表2和图4所示，在自然条件下于旺长期第一次对PVY的发病率及病情指数进行调查，发现对照组烟田PVY的发病率较高，达到了8.4%，但病害程度都较低，大多数病害等级仅为“一级”，病情指数为2.13；施用β-罗勒烯的烟田发病率显著下降仅为4.8%，病情指数仅为0.89，显著低于自然状态下的发病率及病情指数；施用化学农药的田块发病率为5.0%，病情指数为1.20，相比于对照均显著下降，但下降幅度低于施用β-罗勒烯的田块。通过进一步分析得出，施用β-罗勒烯对PVY的防效达到了58.23%，施用化学农药后对PVY的防效为43.66%。于初花期第二次对各处理烟田PVY的发病率及病情指数进行调查，经过统计发现，各处理的发病率及病情指数均有不同程度的上升，其中对照组发病率上升了2.8个百分点，β-罗勒烯组发病率上升1.2个百分点，化学农药组发病率上升了2.6个百分点；对照组病情指数上升了0.7，β-罗勒烯组病情指数上升了0.22，化学农药组病情指数上升了0.36；施用β-罗勒烯后对PVY的防效上升了5.89%，达到64.12%，施用化学农药后PVY的防效上升了3.1%，达到46.76%。综上所述，β-罗勒烯对PVY具有显著的防控效果，且防控效果显著高于化学农药。
Table 2. Effect of different field treatments on the prevention and control of PVY
表2. 大田不同处理对PVY的防治效果
注：不同处理对应的各项数值中不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著。
(A) (B) (C)注：(A)：对照(CK)；(B)：化学农药；(C)：β-罗勒烯。
Figure 4. Incidence of PVY with different treatments
图4. 不同处理PVY的发病情况
3.3. 大田施用β-罗勒烯对马铃薯Y病毒病传播的影响
试验结果如表3所示：β-罗勒烯对PVY的传播及在植株体内的扩散具有显著的控制效果，化学农药对PVY的传播及扩散的控制效果不佳。通过数据统计发现，对照组相比于第一次调查，PVY的发病率上升了11%；施用β-罗勒烯后相比于第一次调查，PVY的发病率仅上升了3.2%；施用化学农药后相较于第一次调查，PVY的发病率上升了6.7%。对照组病情指数上升了5.08，罗勒烯组病情指数上升了1.05，化学农药组病情指数上升了2.98；对照组病情上升率达到了47.61%，罗勒烯组病情上升率仅为10%，化学农药组病情上升率为28.79%。相比于对照，罗勒烯组病情上升率减少了78.99%，化学农药组病情上升率减少了39.53%。综上所述，β-罗勒烯能够激活烟株自身防御系统，增强自身对PVY的抗性。施用β-罗勒烯能显著降低PVY的发病率，且控制效果显著高于施用化学农药；另一方面发病烟株经β-罗勒烯诱导后，PVY在烟株上的蔓延得到有效控制，因此病情指数也得了到有效控制。
Table 3. Effect of different treatments in the field on the propagation and diffusion of PVY
表3. 大田不同处理对PVY的传播及扩散的影响
注：不同处理对应的各项数值中不同的小写字母表示单因素方差分析在0.05水平下，差异显著；第一次调查方式与第二次调查方式相同。
4. 结论
本研究运用室内盆栽试验与大田试验相结合的方法探究了β-罗勒烯对PVY的防控效果。通过室内盆栽试验发现，β-罗勒烯对PVY具有显著的防控效果，接种病毒后，烤烟的发病率、病情指数都显著下降；分子水平检测显示，经β-罗勒烯诱导后的烟株在接种PVY 10天后，烟株体内病毒的积累量显著低于对照组。通过大田实验进一步发现，烤烟经β-罗勒烯诱导后，PVY在大田自然状态下的发病率以及病情指数均显著降低，防治效果相较于使用传统化学农药显著提升；除此之外，本试验对已严重发生PVY的烟田进行防控，发现，经β-罗勒烯诱导后发病烟田的病情得到了有效的控制，相比于施用化学农药控制效果更佳，具体表现为病株的病情指数得到了更有效的控制，健康植株被持续感染的数量显著减少。以上结果都说明，β-罗勒烯在防控PVY上具有巨大的潜力，可以成为一种防控PVY的新方法。
5. 讨论
截至目前为止，针对PVY都没有有效的防治手段。通过培育抗病品种防控PVY是目前最有效的防控方法，但是育种年限较长，且育成品种的各项重要指标是否达到行业要求还无法预料，种种原因都制约着其推广与应用 [7] [8] [9] 。现在针对PVY，近些年兴起了一种利用病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing, VIGS)，促使植株产生对病毒的抗性，从而达到防控PVY的效果 [14] 。这种方法对PVY具有显著的防治效果，但这种方法操作复杂，很难大面积推广，在落后山区更加难以推广。如今，市面上针对PVY的化学农药层出不穷，一方面实际效果达不到满意烟农的需求，另一方面，过度施用化学农药还会造成药害，这情况不符合烤烟绿色生产的理念，种种原因都表明，依靠化学农药对PVY进行防控的效果不佳 [6] 。针对以上情况，现用β-罗勒烯防控PVY能达到良好的防控效果，且这种方法不仅操作简单易于推广，而且还能满足烤烟绿色生产的理念，完全不存在农药残留的情况。通过室内盆栽试验及大田试验研究β-罗勒烯对PVY的防控效果，有利于开发一种有效、新型、绿色、无残留的烤烟PVY防控新方法，为防控PVY提供新的思路及方法打下坚实基础。
致谢
本文在设计、撰写和修改过程中，感谢刘春林教授、阮颖教授、周世民主任给出的宝贵意见，同时也感谢李宏江、林钢参与实验设计及实验结果分析。本研究由湖南省烟草公司长沙市公司项目(CS2023KJ02)资助。
参考文献
NOTES
*同等贡献。
#通讯作者。