1. 引言
淀粉掺杂在食品加工中是一种较为普遍的现象，近年来国内外科研人员围绕淀粉掺杂鉴别问题已展开不少研究，如根据不同淀粉在颗粒超微形貌、结构等上的明显差别，运用扫描电镜、红外光谱等技术区分马铃薯淀粉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、藕粉等 [1] [2] 。另有学者利用淀粉肽指纹图谱鉴别红薯淀粉、马铃薯淀粉及木薯淀粉 [3] 。虽然上述方法在淀粉种类检测中取得了一定的进展，但在实际应用中仍存在各种问题。如光谱法虽能快速识别真假淀粉，但对于掺假物的具体定性仍存在不足。
实时荧光PCR技术通过分析物种DNA水平上的差异来鉴别物种属性，结果准确、可靠，且不受环境因素等影响 [4] ，因此，基于DNA的实时荧光PCR等分子生物学技术在食品鉴伪，特别是加工食品中生物种类鉴定方面的应用越来越多，如鉴定燕窝制品中是否掺杂猪皮、鸡蛋清、琼脂等常见掺假物 [5] ，区分肉制品中鹿肉、牛肉、猪肉成分等。但该技术应用于淀粉制品的掺假的鉴别上存在着一定的困难，这是因为淀粉制品如粉丝、粉条在采用常规方法提取DNA时，由于淀粉含量较高造成溶胀严重，往往不能提取出纯度浓度较好的DNA，无法进行后续的PCR扩增。因此本项目拟开发一种基于实时荧光PCR技术简单快速准确鉴别粉丝粉条中淀粉掺杂的新方法，主要根据现有的DNA提取方法CTAB法，针对其步骤进行改良，以提高检测效率以及检测结果的准确性，避免出现假阴性的实验结果，获取高纯度、合适浓度的DNA进行实时荧光PCR检测。
2. 材料与方法
2.1. 材料
虞城县王恩红薯粉皮加工厂、菏泽中晟经贸有限公司、菏泽市定陶区餐添香淀粉制品厂、汝州市庙下阁子粉皮加工店、曹县众乐嘉食品有限公司等粉皮样品10份、粉丝样品40份，用旋风磨研磨至粉末状，作为本实验的供试材料。
2.2. 试剂
Premix E TaqTM (Probe qPCR)试剂：宝生物公司；TAE溶液(50×)：Biosharp公司；RNA 酶、RNase A、核酸助沉剂、2X (2%) CTAB缓冲液等：Solarbio公司；CTAB、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇醋酸钠等均为市售分析纯。
2.3. 引物和探针
红薯特异性基因的引物探针来自于文献 [6] ，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.4. 仪器与设备
杭州奥盛：Nano-300微量核酸蛋白分析仪、MSC-100干式恒温器；德国耶拿：qTOWER3荧光定量基因扩增仪；LABDIKA公司：ANCER漩涡混合仪；SIGMA公司：3K15高速冷冻离心机、Mini-15K小型离心机；嘉定公司：JXFM110旋风磨。
2.5. 粉丝粉皮制品的DNA提取
2.5.1. 采用简易CTAB法提取样品DNA [7] [8]
1) 取少量实验材料(约200 mg)置于研钵中，用液氮磨至粉状；2) 转移至离心管中，加入2 mL CTAB 提取液和10 μl RNA酶(10 mg/mL)，65℃温育30 min；3) 12000 r/min 4℃离心5 min，取上清700 μL，转入新离心管，加入300 μL氯仿–异戊醇(24:1)抽提；4) 12000 r/min离心5 min，吸取上清500 μL，转入新离心管，加入400 μL氯仿–异戊醇(24:1)抽提；5) 12000 r/min离心5 min，吸取上清400 μL；6) 将上清转入新离心管，加入2.5 mL异丙醇，−20℃静置30 min；7) 12000 r/min离心10 min，弃上清；8) 用75%乙醇洗涤沉淀2遍，静置10 min；9) 加入50 μL 0.5 × TE (含RNase)缓冲液，使DNA溶解，可置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解。
2.5.2. DNA提取方法的比较 [9]
1) 在相同背景条件下，采用不同浓度的CTAB (1%/2%/4%)，比较提取DNA质量；2) 在相同背景条件下，采用不同水浴温度(65℃/70℃)，比较提取DNA质量；3) 在相同背景条件下，采用不同水浴时间(10 min/20 min/30 min)，比较提取DNA质量；4) 在相同背景条件下，采用不同离心温度(4℃/15℃)，比较提取DNA质量；5) 在相同背景条件下，增加多糖(多糖水解酶)的去除步骤，比较提取DNA质量；6) 在相同背景条件下，增加多酚(提取缓冲液中加入1%~2% PVP)的去除步骤, 比较提取DNA质量；7) 在相同背景条件下，增加核酸助沉剂。
2.5.3. 特异性基因的检测
使用Premix E TaqTM (Probe qPCR)试剂盒(宝生物)，扩增反应总体系为25 μL：Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2×) 12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探针0.5 μL，模板2 μL，无菌水8.5 μL，进行实时荧光PCR程序设置：1) 预变性Cycle：1，95℃，30 sec；2) PCR反应Cycle：40，95℃，5 sec，60℃ 30 sec。仪器检测通道设置为FAM荧光。检验过程中设立阳性对照、阴性对照和空白对照。
3. 结果和讨论
DNA提取条件的优化
使用微量核酸蛋白分析仪测定OD260/OD280确定核酸浓度与纯度、特异性基因的检测(图1)比较提取DNA质量。结果见表1。
Table 1. Comparison of DNA extraction methods
表1. DNA提取方法的比较
注：不同曲线代表在相同背景下，分别加多糖(多糖水解酶)、提取缓冲液中加入1%~2% PVP、加入核酸助沉剂进行的实时荧光PCR反应。
Figure 1. Detection of specific genes
图1. 特异性基因的检测
通过DNA提取方法的比较，在相同背景条件下，采用不同浓度的CTAB (1%/2%/4%)、不同水浴温度(65℃/70℃)、不同水浴时间(10 min/20 min/30 min)、不同离心温度(4℃/15℃)，如表1中序号1~10实验结果所示对提取DNA质量影响不大，不能够提取出特异性基因；在相同背景条件下，增加多糖(多糖水解酶)的去除步骤、增加多酚(提取缓冲液中加入1~2% PVP)的去除步骤，如表1中序号11~12实验结果所示对提取DNA质量能够提取出特异性基因，但是纯度较低；在相同背景条件下，增加核酸助沉剂，如表1中序号13实验结果所示对提取DNA质量能够提取出特异性基因，纯度较高。
4. 讨论与结论
粉丝粉条在用常规DNA提取方法进行提取时，由于淀粉含量较高造成溶胀严重，不能提取出纯度浓度较好的DNA。因此本实验主要根据现有提取方法CTAB法，针对其步骤进行改良，发现在相同背景条件下，采用不同浓度的CTAB (1%/2%/4%)、不同水浴温度(65℃/70℃)、不同水浴时间(10 min/20 min/30 min)、不同离心温度(4℃/15℃)，对提取DNA质量影响不大，不能够提取出内源基因；在相同背景条件下，增加多糖(多糖水解酶)的去除步骤、增加多酚(提取缓冲液中加入1~2% PVP)的去除步骤，对提取DNA质量影响较大，能够提取出内源基因，但是纯度较低；在相同背景条件下，增加核酸助沉剂，对提取DNA质量影响较大，能够提取出内源基因，且纯度较高。但是本实验未将在相同背景条件下，同时增加多糖(多糖水解酶)的去除步骤、多酚(提取缓冲液中加入1~2% PVP)的去除步骤、核酸助沉剂三个步骤进行实验，因为只增加核酸助沉剂就能够很好地提取出高纯度的DNA。本实验提高了检测效率以及检测结果的准确性，避免出现假阴性的实验结果，获取高纯度、合适浓度的DNA进行实时荧光PCR检测，为市售粉丝粉条提供快速、准确的鉴别技术手段。
本实验研究的局限性在于只是使用微量核酸蛋白分析仪测定OD260/OD280确定核酸浓度与纯度以及特异性基因的检测来判断DNA提取的效果，并未使用凝胶电泳方法来判断是否提取处理目的基因条带，在未来的研究方向考虑加入凝胶电泳方法来进一步判断并优化DNA提取的效果。