1. 引言
胃癌具有高发病率和死亡率，已成为了全球范围内一项严峻的公共卫生问题。据2020年统计，胃癌在36种癌症中居第5位，全球新确诊病例超过108万例 [1] 。对于改善患者的预后和总体生存状况，早期诊断显得至关重要，晚期诊断往往导致预后不良，并限制了对化疗或姑息治疗的有效干预 [2] 。近期，免疫疗法作为一种颇受关注的治疗策略，在晚期胃癌中表现出巨大潜力 [3] 。在免疫治疗中，免疫应答始于免疫系统对抗原(病原体或异常细胞表面的特定分子)的识别，并导致免疫系统中各种类型的细胞被激活，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等。这些细胞通过相互作用和释放细胞因子等方式，协同合作来执行免疫活性。由于免疫应答的复杂性，该疗法在患者中的效果存在显著差异 [4] 。因此，确立可预测患者预后的生物标志物，对于更精准地指导治疗方法具有重要意义。
核因子E2相关因子2 (NRF2)，由NFE2L2基因编码，包含七个Neh结构域，是一种在所有细胞类型中表达的转录因子。在肿瘤发生中，NRF2发挥着双重作用。一方面，通过激活生物转化，NRF2可预防化学致癌的发生，另一方面，NRF2的过度表达与某些肿瘤的发展和药物耐药性有关 [5] [6] [7] 。据报道，在胃癌患者中，NRF2呈阳性表达的患者总体生存明显低于呈阴性表达者 [8] 。此外，通过细胞研究和动物实验的充分支持，NRF2已被确定为黑色素瘤中程序性死亡配体1 (PD-L1)的一个关键上游调控因子 [9] 。鉴于PD-L1作为免疫疗法的主要靶点，可以推测NRF2表达与免疫疗法预后之间存在一定关联。
本研究旨在深入探讨胃癌中NRF2和PD-L1表达之间的相互关系，评估其在临床上的重要意义，并分析它们与肿瘤免疫微环境之间的关联。我们的研究结果强调了NRF2在胃癌免疫疗法中可能充当指导因素的潜在作用。
2. 材料和方法
2.1. 细胞系和培养
人类胃上皮细胞系(HGC-27)来源于Procell Life Science & Technology Co., Ltd.并在本实验室中得以维护。所有细胞系均在Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(Invitrogen)中培养，添加10%的胎牛血清(Hyclone)，并置于37℃和5% CO2的培养环境中。
2.2. RNA提取和反转录–定量PCR (RT-qPCR)
每个细胞系的总细胞RNA采用TRIzol™试剂(Invitrogen)依照制造商提供的方案进行提取。RT-qPCR扩增的引物序列如下：Nrf2的前向引物为5’-GCTGAACGCCCCATACAACAAAATC-3’，反向引物为5’-CTCAGGACTTGATGGTCACTGCTTG-3’；GAPDH作为内参的前向引物为5’-GTCTCCTCTGACTTCA ACAGCG-3’，反向引物为5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。对于每个样本，Nrf2的表达水平均被调整为GAPDH的表达水平。
2.3. 患者和样本
本研究纳入了在2020年1月至2022年12月期间在青岛大学附属医院肿瘤科二病区就诊的30名确诊为胃癌的患者。纳入标准包括：(1) 经过病理学诊断确认为胃癌；(2) 接受晚期一线化疗且>2周期的患者；(3) 具有完整的病历记录；(4) 一线治疗前在青岛大学附属医院留存肿瘤标本。排除具有其他类型恶性肿瘤史、其他肿瘤类型的转移以及临床记录不完整的患者。所有患者均签署知情同意书。我们回顾性收集了这30名患者的临床病理数据，包括性别、PD-L1综合阳性评分(CPS)、是否存在肝转移和腹膜转移。本研究遵循赫尔辛基宣言，经青岛大学附属医院伦理委员会批准。
2.4. 免疫组化分析
我们采集了这30名患者的胃癌组织石蜡样本，随后进行了切片处理。对这些组织样本进行免疫组织化学染色，以评估NRF2的表达情况。
采用H-score系统对NRF2表达的强度进行评估，该系统使用以下公式进行计算：H-Score = ∑(pi × i)，其中pi表示阳性信号像素面积/细胞数量的比例；i代表着色强度。H分数通过将(弱强度百分比 × 1)、(中等强度百分比 × 2)和(强强度百分比 × 3)的值相加而确定。根据中位数分数，患者被分为两组：高NRF2表达组和低NRF2表达组。最后，由一位病理学家对结果进行确认。
2.5. 评估
所有患者均为晚期患者，通过胃镜活检或姑息手术标本进行了原发性胃癌的病理学诊断。所有标本由两位经验丰富的病理学家独立进行病理诊断，且在审查过程中对患者的临床和复发数据一律不知情。无进展生存(PFS)定义为从一线治疗开始的日期到首次记录到进展或最后一次随访且未进展的日期之间。每位患者在一线治疗期间遵循规律的随访计划，该计划要求每两个月进行一次检查，包括体格检查、实验室检查和影像研究。在这些影像检查中，主要采用动态增强计算机断层扫描(CT)。
2.6. 统计分析
数据使用SPSS 27.0.1 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)进行分析。数据以数值和百分比形式呈现，并经过Fisher的精确检验。对PFS采用Kaplan-Meier方法和log-rank检验进行评估。所有收集的参数都通过Cox比例风险模型进行单变量和多变量生存分析。多因素回归分析使用logistic回归的前向选择方法。统计学上显著定义为p < 0.05。
2.7. 数据库分析
TIMER和TISIDB数据库被用于进行差异表达分析，探索NFE2L2与免疫微环境之间的关系。在TIMER分析中，我们选择了EPIC算法 [10] 。
3. 结果
3.1. 揭示转录调控：PD-L1作为NRF2的靶点
为了确认NRF2对PD-L1转录的调控，我们分别将两种类型的siRNA引入HGC27细胞，以降低NRF2的表达，并将空载体siRNA引入HGC27细胞作为对照。使用RT-qPCR评估PD-L1 mRNA的表达，并分析PD-L1 mRNA水平。在HGC27细胞中沉默NRF2显著降低了PD-L1 mRNA的表达(图1)，证实了NRF2在PD-L1调控中的关键作用。这些发现表明PD-L1可能受NRF2的调控。
Figure 1. RT-PCR analysis of NRF2 expression post siRNA transfection
图1. RT-PCR分析siRNA转染后NRF2的表达
3.2. 患者的临床病理特征
本回顾性研究共纳入30名胃癌患者。对所有患者进行了免疫组织化学分析，结果显示NRF2在胃癌细胞的细胞膜和细胞质中表达。在400×放大倍数下分别观察到NRF2高表达和低表达(图2)。
Figure 2. Microscopic observations of NRF2 overexpression and underexpression
图2. NRF2高表达和低表达的镜下表现
在入组的30名患者中，男性有21名(70.0%)，女性有9名(30.0%)。接受化疗联合免疫治疗的患者有22名(73.3%)，仅接受化疗的患者有8名(26.7%)。有8名患者(26.7%)伴有肝转移，9名患者(30.0%)伴有腹膜转移。所有患者均被诊断为IV期疾病。根据NRF2表达水平的中位数，入组患者被分为两个亚组，表1展示了纳入患者的全面临床病理特征。在NRF2的高表达组和低表达组中，在性别(p = 1.00)、肝转移(p = 0.215)、腹膜转移(p = 0.426)、PD-L1表达(p = 1.00)和治疗方案(p = 0.215)方面均未观察到显著差异。
Table 1. The correlation between clinical pathological characteristics and the expression levels of NRF2 in gastric cancer patients (n = 30)
表1. 胃癌患者临床病理特征和NRF2的表达水平的相关性(n = 30)
3.3. NRF2高表达患者中免疫疗法的显著PFS优势
我们采用RECIST 1.1标准评价了治疗方式的疗效，并深入研究了其与Nrf2表达之间的关联(表2)。在本研究中，共有22例患者接受了免疫联合治疗，其中77%的患者采用了纳武利尤单抗(17/22)，9%的患者使用了信迪利单抗(2/22)，而14%的患者则选择了卡瑞丽珠单抗(3/22)。在免疫联合治疗组中，有13例患者表现为NRF2低表达，而9例患者表现为NRF2高表达。在NRF2低表达的患者中，30.8%的患者在接受治疗后表现出缓解(4/13)，而在NRF2高表达的患者中，有44.4%的患者表现出了缓解(4/9)，这一结果明显优于应用于低表达患者群体的疗效水平。此外，共有8例患者接受了单纯化疗，其中2例为NRF2低表达，而6例为NRF2高表达。在NRF2低表达的患者中，未观察到患者在治疗后表现出缓解；然而，在NRF2高表达的患者中，有50%的患者在治疗后表现出缓解(3/6)。
我们首先对NRF2高表达与低表达患者的一线PFS进行比较，结果显示两组之间没有达到统计学显著差异(p = 0.842) (图3(a))。然后分析比较了不同治疗方式下的PFS。与仅接受化疗的患者相比，接受化疗和免疫疗法联合治疗的患者PFS表现出了显著改善(p = 0.015) (图3(b))。
Table 2. The association between optimal therapeutic efficacy and the expression levels of NRF2
表2. 最佳治疗疗效和NRF2的表达水平的关联
(a) 
(b) 
(c) 
(d)
Figure 3. (a) Kaplan-Meier survival analysis based on NRF2 expression; (b) Kaplan-Meier survival analysis based on treatment modality; (c) Kaplan-Meier survival analysis based on the treatment modality in the NRF2 overexpression group; (d) Kaplan-Meier survival analysis based on the treatment modality in the NRF2 underexpression group
图3. (a) 基于NRF2表达的Kaplan-Meier生存分析；(b) 基于治疗方式的Kaplan-Meier生存分析；(c) NRF2高表达组中基于治疗方式的Kaplan-Meier生存分析；(d) NRF2低表达组中基于治疗方式的Kaplan-Meier生存分析
为深入分析，我们将NRF2高表达和低表达的患者分别研究。在NRF2高表达的患者队列中，接受化疗和免疫疗法联合治疗的患者相较于仅接受化疗的患者表现出显著更好的PFS (p = 0.008) (图3(c))。1年PFS率分别为16.67% (1/6)和66.67% (6/9)。然而，在NRF2低表达的患者中未观察到这一发现(p = 0.711) (图3(d))。我们进一步采用COX比例风险回归模型研究了各种临床特征与一线患者PFS之间的相关性(表3)。单变量分析表明，在整个晚期患者中，仅接受化疗与PFS存在显著关联(HR = 3.27, 95% CI: 1.20, 8.93)，而性别、肝转移、腹膜转移、PD-L1 CPS评分与PFS无关。在NRF2表达高于平均水平的亚组中，与接受联合免疫疗法的患者相比，仅接受化疗的患者预后较差(HR = 5.58, 95% CI: 1.36, 22.92)，而没有腹膜转移的患者预后较好(HR = 0.14, 95% CI: 0.02, 0.86)。考虑到这些因素的临床意义，我们将所有变量纳入多变量分析。对于整个人群，我们未发现独立的预后因子。然而值得注意的是，在NRF2高表达的患者中，我们发现治疗模式是一个独立的预后因子，接受仅化疗的患者预后较差于接受免疫联合治疗的患者(HR = 4.51, 95% CI: 1.06, 19.22) (表4)。
Table 3. Cox proportional hazards regression for PFS in a cohort of 30 patients
表3. 30名患者PFS的COX比例风险回归
Table 4. Cox proportional hazards regression for PFS in a subgroup of 15 patients with high NRF2 expression
表4. 15名NRF2高表达患者PFS的COX比例风险回归
在我们的研究中，研究结果提示接受了免疫联合治疗的患者出现了3例免疫相关性疾病，分别是免疫性肺炎、免疫性肠炎、溃疡性结肠炎，而仅接受化疗的患者不良反应多为消化道症状及中性粒细胞的减低。
3.4. NRF2表达与免疫微环境相关
为了更进一步验证NFE2L2在胃癌组织中的表达情况，我们借助TIMER数据库对比了恶性肿瘤和相应正常组织中NFE2L2的表达水平。分析结果提示，在胃腺癌(STAD)组织中NFE2L2呈现显著的过表达(图4)。此外，本研究利用TIMER数据库探索了NFE2L2表达与胃癌中免疫细胞浸润的相关性，我们观察到NFE2L2的表达与自然杀伤细胞(NK细胞) (p = 2.69e−03)、CD4+T细胞(p = 4.22e−11)、内皮细胞(p = 1.82e−02)以及CD8+T细胞(p = 1.31e−3)的表达之间存在显著相关性(图5)。
Figure 4. Analysis of differential NRF2 expression patterns in various cancer types using the TIMER database
图4. TIMER数据库分析不同癌症类型中NRF2表达模式的差异
Figure 5. The correlation between NFE2L2 expression and immune cell infiltration in STAD
图5. NFE2L2表达与STAD免疫细胞浸润的相关性
通过TISIDB数据库的深入分析，结果显示NFE2L2在免疫调控分子上发挥着关键作用。其同免疫抑制分子具有正向相关性，包括TGFB1、IL10RB、ADORA2A和CD274 (PD-L1) (图6)，同时与免疫刺激分子亦具有相关性，如TNFSF15、TNFSF13、TNFSF4、TNFRSF25、TNFRSF18、TNFRSF13C、TNFRSF13B、TNFRSF9等(图7)。此外，NFE2L2与B2M的相关性可能使其在主要组织相容性复合体(MHC)中发挥作用(图8)。在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)方面，NFE2L2的表达与CD4、树突状细胞(DCs)、CD56bright、CD56dim、不成熟DCs、巨噬细胞、Th17和Tregs等免疫细胞类型相关(图9)。然而，免疫亚型和分子亚型与NFE2L2的表达并未显示出明显的关系(图10)。此外，NFE2L2还调控了一些趋化因子，如CCL28、CCL25、CCL21和CCL20 (图11)，以及相应的受体，如CXCR5、CCR10和CCR8 (图12)，在调节免疫过程中发挥了调控作用。
Figure 8. The correlation between NFE2L2 expression and MHC molecules
图8. NFE2L2表达与MHC分子的相关性
4. 讨论
胃癌是一种全球性的疾病，由于常在晚期被诊断，胃癌具有较高的死亡率，是癌症相关死亡的第三大主要原因 [2] [11] 。化疗在改善局部晚期、不能切除或转移性胃癌患者的生存和生活质量方面，发挥着关键作用 [12] [13] 。化疗可以抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积，提高手术切除率，甚至将不可切肿瘤转化为可切，常常通过影像学检查或者血检验等方式来评估疗效。然而，随着肿瘤免疫学的进展，免疫疗法已逐渐成为治疗各种癌症的一种前沿手段，使某些晚期肿瘤患者得以延长生存。对于包括胃癌在内的各种癌症，针对PD-1/PD-L1或CTLA-4的免疫检查点抑制剂已显示出充满希望的前景 [14] [15] [16] 。然而，免疫疗法新靶点的匮乏以及受益群体范围的模糊使免疫治疗仍然是一个持续存在的挑战。因此，我们旨在探讨NRF2在免疫疗法应答和胃癌患者预后中的作用。
NRF2，又称为核因子E2相关因子2，是一种被NFE2L2基因编码的转录因子。它作为细胞抗氧化应答的关键环节，其活性通过与Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)的相互作用来调控 [17] [18] 。KEAP1/NRF2转录活性的失调已被认为与多种疾病的发病机制有关，强调了它在细胞稳态中的关键作用 [19] [20] [21] 。然而，NRF2在癌症中的激活作用是复杂的，需要进一步的研究 [10] [17] [22] [23] [24] [25] 。此外，肿瘤中NRF2表达与癌症发生过程的关系仍然不明确。
Figure 10. The correlation between NFE2L2 expression and immune types and molecular subtypes
图10. NFE2L2表达与免疫类型及分子亚型的相关性
Figure 12. The correlation between NFE2L2 expression and chemokine receptors
图12. NFE2L2表达与趋化因子受体的相关性
在胃癌患者中，升高的NRF2表达与癌症的进展和药物耐药性有关 [8] [26] [27] [28] ，这表明NRF2在肿瘤发生中发挥着重要的作用。先前的研究报道了NRF2在黑色素瘤中直接调控PD-L1的转录。在18个PD-L1高表达的标本中，所有(100%)标本检测到NRF2的阳性表达，但在33个PD-L1低表达的标本中，只有23个(69.7%)标本检测到NRF2的阳性表达。PD-L1的表达与NRF2显著相关(r = 0.7768, p < 0.0001, n = 92) [7] 。在本研究中，我们通过PCR观察到，在NRF2下调条件下，PD-L1的表达水平降低，这与先前的研究结果一致。鉴于NRF2的下调导致PD-L1表达降低，我们对晚期胃癌患者进行了生存分析。统计数据显示，在所有患者中，接受免疫联合治疗的患者的1年PFS率为86.36% (19/22)，而仅接受化疗的患者的率为12.5% (1/8)。在高NRF2表达人群中，接受免疫联合治疗的胃癌患者与仅接受化疗的患者相比，1年一线PFS率更高(66.67% vs. 16.67%)。在低表达组中没有类似的发现。使用COX比例风险回归模型的单因素和多因素分析发现，是否接受联合免疫治疗是高NRF2表达人群的独立预后因素。本研究的对象都是晚期患者，他们多数进行活检以获得少量病变组织进行诊断。这一人群可能需要进一步的诊断或治疗，在伦理上，针对这一群体的研究必须选择在采集后保留足够组织样本的方式进行。为了增加样本量，我们努力收集在青岛大学附属医院存储的病理标本。我们希望通过这项研究提供具有指导性的临床证据。
为确认NRF2表达与胃腺癌(STAD)中免疫细胞浸润的关联，我们使用TIMER数据库进行分析，发现NFE2L2表达与CD4+、CD8+、NK和内皮细胞的存在呈正相关。值得注意的是，CD8+和CD4+ T细胞浸润在肿瘤中具有显著的预后价值 [29] [30] [31] 。此外，通过TISIDB数据库的分析，我们进一步研究了NRF2表达与胃癌患者肿瘤免疫微环境之间的关系，揭示了NRF2表达与TILs (肿瘤浸润淋巴细胞)、免疫调节因子和趋化因子之间的显著相关性。
在肿瘤微环境(TME)中，除了癌细胞外，还包含一系列免疫细胞、基质细胞、内皮细胞和癌相关成纤维细胞 [32] [33] 。肿瘤微环境在肿瘤逃逸和免疫治疗预后中起着重要作用 [32] [34] [35] [36] [37] 。基于我们的研究结果，我们推测NRF2在胃癌进展中与浸润的免疫细胞相互作用，从而影响肿瘤免疫微环境和癌症预后。多种免疫细胞的积聚可能归因于CD8+ T淋巴细胞的浸润，后者可能通过从细胞表面触发特定信号的释放来吸引其他免疫细胞。这一机制似乎调节了免疫细胞参与肿瘤发生过程 [38] 。我们的研究全面考察了细胞实验、临床试验和生物信息学分析，为NRF2作为免疫疗法潜在标志物提供了系统的证据。这种潜在的关联可能源于其对PD-L1或免疫微环境的调节。然而，值得注意的是，我们的研究缺乏动物实验，并且由于可用的足够组织标本有限，目前的研究仅包括了数十名患者。为了全面阐明NRF2在胃癌免疫疗法中的作用，需要进行更深入的基础实验和更大规模的临床研究。
基金项目
北京市希思科临床肿瘤学研究基金项目(Y-HR2018-185)；山东省医药卫生科技发展计划项目(202103030554)。
NOTES
*通讯作者。