1. 引言
对虾传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis, IHHN)也称慢性矮小残缺综合征(Runt-deformity syndrome, RDS)，于1981年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)首次发现 [1] 。该病的致病原为传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是引起全世界养殖对虾病害的主要病原之一，已经被世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health, WOAH)划定为需向其申报的甲壳动物疫病之一 [2] 。我国拥有全球最大的对虾养殖产业，养殖生产总量占居世界第一。近年来由于对虾养殖规模的不断扩大，病毒性疫病的问题也日益严重，其中传染性皮下及造血组织坏死病作为危害最为严重的对虾病毒之一对我国对虾养殖产业带来的不良影响也不容忽视。
IHHNV能够感染多种对虾，特别是对幼虾的危害尤为明显。1983年，Lightner报道了关于从哥斯达黎加和厄瓜多尔商业进口到夏威夷的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)幼虾90%死亡的案例 [3] ，Hsieha等也报道了IHHNV导致大量幼年的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)死亡事件 [4] 。IHHNV也可以引起成虾的患病，据报道IHHNV可以导致凡纳滨对虾 [5] 和斑节对虾(Penaeus monodon) [6] 产生慢性矮小残缺综合征(RDS)，该病致死率不高，是一种慢性疾病，具体表现为生长缓慢、额肩歪斜、角质层和吻部畸形等，最终导致商品虾规格参差不齐，产量明显下降，经济损失严重等后果。Lightner等研究还发现，感染IHHNV或患病后存活下来的细角滨对虾和凡纳滨对虾会终生带毒，并可通过垂直和水平的传播方式把病毒传染给下一代或其他物种 [7] 。对虾病毒性疫病暴发后情况难以控制，迄今为止人们尚无针对IHHNV感染的有效防治措施，因此快速、便捷、灵敏的检测技术的开发与应用就变得尤为重要。
目前已开发应用于检测对虾病毒疫病的方法主要包括组织病理、斑点原位杂交、聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR等方法。WOAH推荐的IHHNV检测方法为普通PCR方法和荧光定量PCR方法，我国现行针对该病的国家标准也只推荐了普通PCR的检测方法。基于PCR检测原理研发的检测技术虽然灵敏度高，特异性强，但耗时长，不仅需要昂贵的仪器设备还需要专业技术人员进行操作，使用范围基本仅限于科研单位和检疫机构，无法在实际生产中推广使用。本研究在综合考虑应用成本、操作简便程度以及适用性等方面，将GenBank登录的IHHNV基因保守序列进行充分比对分析后，设计了3对特异性引物，建立了该病毒的LAMP检测方法，可以快速、准确地检出IHHNV病毒。该方法不需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，只需要一台简单的水浴锅或恒温加热器即可，成本低廉、方便携带，生产一线技术人员经过简单培训就可以轻松掌握，非常适用于在实际生产中推广使用，同时也能够为国际上对虾贸易往来过程中该病的实时监控提供可靠的技术手段。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 病虾来源
患病的凡纳滨对虾采集自天津市滨海新区某对虾养殖基地，具有典型的IHHNV感染症状，经IHHNV国标方法检测 [8] 并测序后确认为IHHNV感染，由本实验室保存；经检测未感染IHHNV的对虾组织核酸以及携带南美白对虾常见疫病的病料核酸(包括对虾白斑病、高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫病、对虾偷死病、对虾虹彩病毒病以及对虾肌肉白浊病)均由本实验室保存。
2.1.2. 主要仪器和试剂耗材
主要仪器：PCR仪(ABI)、凝胶成像系统(BioRad)、金属浴(天根生物)、冷冻离心机(Sigma)、电泳仪(北京六一)、移液器(Eppendorf)、核酸检测仪(NanoDrop)等；
试剂耗材：海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒(天根生物)；10 mM dNTP、质粒提取试剂盒(TakaRa)；BstDNA聚合酶(NEB)、钙黄绿素染料(北京蓝谱)、甜菜碱(Sigma)等，本文所用引物均由Invitrogen合成。
2.2. 方法
2.2.1. IHHNV-LAMP引物设计
根据GenBank已登录的IHHNV全部毒株序列，经生物软件Clustal X找到保守序列区，综合分析后最终选取IHHNV-VN (GenBank登录号：JN616415.1)为靶基因，利用在线设计软件Primer Explorer version 5 (http://primerexplorer.jp/e)，按照引物设计原则，设计并筛选出6条最佳用于IHHNV扩增的LAMP引物序列(表1)，分别命名为外引物IHHNV-F3/IHHNV-B3，内引物IHHNV-FIP/IHHNV-BIP和环引物IHHNV-LF/IHHNV-LB。
Table 1. Primer sequence for IHHNV-LAMP
表1. IHHNV-LAMP引物序列表
2.2.2. LAMP反应体系的优化
将感染IHHNV对虾的基因组DNA作为LAMP扩增反应的模板，在基础反应条件为63℃ 60 min，80℃ 10 min的条件下进行反应。其基础反应体系为：2.5 μl 10× BstDNA聚合酶buffer，3.5 μl 10 mM dNTP，1.5 μl 100 mM MgSO4，0.4 μl 100 μM IHHNV-FIP，0.4 μl 100 μM IHHNV-BIP，0.2 μl 100 μM IHHNV-LF，0.2 μl 100 μM IHHNV-LB，0.05 μl 100 μM IHHNV-F3，0.05 μl 100 μM IHHNV-B3，8 Units BstDNA聚合酶，1 μl钙黄绿素染料，3 μl 5M甜菜碱，灭菌水适量，2 μl模板，总体系共25 μl。
在上述基础反应条件的基础上，分别进行最适反应条件和反应体系的优化实验。反应条件：分别设定扩增温度为63℃、64℃、65℃和66℃，扩增时间为30 min、40 min、50 min和60 min；灭活温度为80℃、85℃和95℃，灭活时间为5 min、7 min和10 min的扩增条件，进行交叉实验优化最佳反应条件。
反应体系：分别设定5M甜菜碱加入量梯度为1 μl、2 μl、3 μl和4 μl；10 mM dNTP加入量梯度为2 μl、3 μl、3.5 μl和4 μl；100 mM MgSO4加入量梯度为1.5 μl、2.5 μl和3.5 μl；BstDNA聚合酶加入量梯度为1.5 μl、2.5 μl和3 μl，进行交叉实验优化最佳反应体系，最终优化出IHHNV-LAMP的最佳扩增效率体系。
2.2.3. 灵敏度实验
将用于IHHNV-LAMP引物设计的VN基因序列与pUC57载体连接，构建VN-pUC57质粒，质粒构建工作由上海生工完成。利用质粒提取试剂盒提取VN-pUC57质粒，利用核酸检测仪测定所提取质粒的初始浓度，根据公式：质粒拷贝数/μl = 质粒浓度(g/μl)/质粒分子量×阿佛加德罗常数，计算出VN-pUC57质粒拷贝数为6 × 109，用灭菌水按10倍递进稀释法将质粒稀释到6 × 109、6 × 108、6 × 107、6 × 106、6 × 105、6 × 104、6 × 103、6 × 102、60、30、6个质粒个数，分别作为模板加入到相同的IHHNV-LAMP反应体系中，水浴65℃放置30分钟后观察结果。
2.2.4. 特异性实验
以携带南美白对虾常见疫病的病料核酸(包括对虾白斑病、高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫病、对虾偷死病、对虾虹彩病毒病以及对虾肌肉白浊病)为模板进行IHHNV-LAMP特异性实验。分别将6种携带南美白对虾常见疫病的病料核酸和确认携带IHHNV的对虾病料核酸加入到LAMP反应体系中进行扩增，检测本研究建立的IHHNV-LAMP检测体系的特异性。
2.2.5. 准确性实验
挑选40尾具有典型感染IHHNV症状的对虾，每尾虾同时采用国标方法和IHHNV-LAMP检测方法进行IHHNV的检测，将这两种方法得到的结果进行比较，判断LAMP方法的准确性。
3. 结果与分析
3.1. IHHNV-LAMP的优化结果
综合分析经各反应条件和反应体系的交叉实验结果，最终确定最佳反应条件为：65℃ 30 min，95℃ 5 min；IHHNV-LAMP扩增效率最佳的反应体系为：2.5 μl 10× BstDNA聚合酶buffer，3 μl 10 mM dNTP，2.5 μl 100 mM MgSO4，0.4 μl 100 μM IHHNV-FIP，0.4 μl 100 μM IHHNV-BIP，0.2 μl 100 μM IHHNV-LF，0.2 μl 100 μM IHHNV-LB，0.05 μl 100 μM IHHNV-F3，0.05 μl 100 Μm IHHNV-B3，8 Units BstDNA聚合酶，1 μl钙黄绿素染料，1 μl 5M甜菜碱，2 μl模板灭菌水定容总体积至25 μl。
3.2. IHHNV-LAMP反应体系的灵敏度
如图1所示：加入重组质粒个数从6 × 109个到6个的IHHNV-LAMP反应体系均显示了阳性结果，未加入重组质粒的IHHNV-LAMP反应体系显示结果为阴性，因此该IHHNV-LAMP反应体系的灵敏度(检测下限)为6个病毒粒子。
Figure 1. The sensitivity of IHHNV-LAMP reaction system
图1. IHHNV-LAMP反应体系的灵敏度
3.3. IHHNV-LAMP反应体系的特异性
如图2显示：本研究建立的IHHNV-LAMP检测方法只对IHHNV阳性基因组扩增，而对其它6种水生动物常见病原DNA均没有扩增反应，说明建立的IHHNV-LAMP检测方法与对虾其它常见病毒病的病原均无交叉反应，特异性良好。
Figure 2. The specificity of IHHNV-LAMP reaction system
图2. IHHNV-LAMP反应体系的特异性
3.4. IHHNV-LAMP快速检测试剂盒的准确性
通过对40尾具有感染IHHNV典型症状的对虾样品的检测，结果显示(见图3)：IHHNV-LAMP检测方法能检出39尾阳性，阳性检出率为97.5%；采用国标方法进行检测能检出34尾阳性，阳性检出率为85%，且其中11号、12号、13号、15号、16号、20号、21号和25号样品为弱阳性(统计结果见表2)。说明IHHNV-LAMP快速检测方法与传统国标方法相比灵敏度和准确性更高。
4. 讨论
IHHNV病毒粒子大小在20~22 nm之间，基因组大小约4.1 kb，根据其形态学及生物化学等特性被分类为细小病毒科(Parvoviridae)，其核酸为单链线性DNA，主要以负链的形式存在 [9] 。目前，GenBank已收录部分IHHNV地理株基因组序列，地理株主要分布于美国、中国、越南、澳大利亚、泰国、韩国和印度等地，IHHNV基因组序列包括了所有编码序列和大部分非编码序列，其两端的非编码序列仍然缺少 [10] 。一些研究表明，不同地区分离到的IHHNV分离株之间病毒基因组序列存在一定差异，Tang等对
Figure 3. Comparison results of IHHNV-LAMP and PCR method for 40 shrimp samples with typical symptoms of IHHNV infection (Box: Negative samples in LAMP test results; Ellipse: Negative sample in PCR detection results)
图3. 40尾具有感染IHHNV典型症状对虾样品的IHHNV-LAMP快速检测试剂盒与传统PCR方法检测结果的比对(方框：LAMP检测结果中的阴性样品；椭圆：PCR检测结果中的阴性样品)
Table 2. Comparison of LAMP and PCR detection results for sick shrimp samples
表2. 患病对虾LAMP和PCR检测结果的比较
1982年至1997年间美国地区收集的14个不同IHHNV分离株进行序列比对，发现存在0.5%的核酸差异，对从东南亚地区以及非洲地区收集到的14个不同IHHNV分离株序列分析发现分别存在8.2%和14.1%的较大差异 [11] 。另外，还有研究表明IHHNV 基因型分又为感染型和非感染型两种，其中感染型包括1型和2型；非感染型包括3A和3B型。1型分布于美国和东亚，主要是菲律宾，2型分布于东南亚，3A型分布于东非、印度和澳大利亚，3B型分布于印度太平洋地区包括马达加斯加、毛里求斯和坦桑尼亚 [12] 。综上可见，IHHNV基因组序列存在多样性，且编码蛋白基因序列较短，同时还可能存在与宿主基因组整合的现象 [13] ，因此针对IHHNV基因组序列设计扩增引物时不仅需要在比对现有IHHNV基因组的前提下，找到保守且能够代表具有致病性特征的基因序列作为目标序列，还要与本地区流行病毒株相吻合，这也就很好地解释了很多业内工作者在开发IHHNV各种检测方法过程中，普遍认为引物难设计，且扩增效率不高，检出率不稳定等各种困难。本研究在了解我国地区IHHNV主要流行毒株的前提下，充分比对了不同IHHNV地理株基因组序列，最终选取了IHHNV-VN (GenBank登录号：JN616415.1)为靶基因进行LAMP引物序列的设计，在比较筛选了多种引物对的情况下，最终优选出本文发表的6条引物序列，其特异性、灵敏度、准确性及可重复性均表现良好。
IHHNV迄今为止没有有效的防治方法和药物，只有通过全面及时的检测和综合预防来避免病毒的传播和爆发，一方面对亲本进行严格检疫，切断病毒垂直传染途径，另一方面应在养殖过程中及时监测，防治病害的暴发和流行。因此，建立快速、有效、准确的检测和诊断技术是预防此类疫病的重要技术手段。传统的检测方法主要有肉眼观察和组织学方法，组织学方法不适用于常规的快速检测。PCR、荧光定量PCR以及酶联免疫吸附试验(ELISA)应用于检测水生动物病毒性疫病，操作复杂，需要昂贵的实验仪器和专业的技术人员，限制了在生产中的推广应用。环介导等温扩增技术(LAMP)可结合特定的荧光染料从而出现肉眼可见的显色反应，人们可以根据颜色的变化来得出结果，非常适用于实际生产中实时追踪检测疫病的携带情况。何琳 [14] 、Arunrut [15] 、葛辉 [16] 等均建立了IHHNV环介导等温扩增技术，李红梅 [17] 、俞焕腾 [18] 建立了检测IHHNV的实时荧光定量环介导等温技术。本研究也采用了环介导等温扩增技术开发了IHHNV快速检测技术，与上述文献相比，采用的实验方法相同，但其反应时间大大缩短，不仅节省了时间，还避免了由于反应时间过长导致的假阳性出现，另外该方法通过构建的质粒进行灵敏度测定，其最低检出限达到6 copies/μl，且阳性检出率高于现行国标方法，相较其他文献灵敏度显著提高，推测这与引物扩增效率高，特异性强存在一定关系。
5. 结论
本研究建立的IHHNV-LAMP检测方法具有简便、快速、特异性强、灵敏度高等优点。在优化了反应条件和反应温度后，其灵敏度达到了6 copies/μl，30 min内就可以完成对IHHNV的定性检测，且与对虾其它常见疫病均无交叉反应，该技术适用于在实际生产一线使用，为IHHNV的池边临床快速诊断和大规模疫病的监控提供了技术支撑。
基金项目
天津市农业产学研“揭榜挂帅”关键技术集成攻关类项目“南美白对虾池塘高密度养殖疫病防控技术的集成应用”，项目编号：GBGG202301。
天津市科技计划项目“盐碱水凡纳滨对虾养殖与病害防控技术示范与应用”，项目编号：22ZXBTSN00080。
NOTES
*通讯作者。