1. 引言
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，死亡率高居女性生殖系统恶性肿瘤之首，由于卵巢癌发病隐匿，且缺乏明显的早期临床症状、体征及有效的筛查、诊断方法，大约60%~70%的卵巢癌患者就诊时已处于FIGO分期的III期或IV期，预后较差，且易复发，严重威胁女性生命健康 [1] [2] 。卵巢癌的治疗方式主要为手术治疗、放射治疗、化学治疗，靶向治疗、中医药治疗等。然而卵巢癌患者5年生存率仍然较低。目前一些基因芯片、蛋白质组学、免疫组化学及其他方法用于卵巢癌诊断，但对早期卵巢癌筛查、诊断仍然没有较高的敏感性和特异性的肿瘤标志物 [3] 。因此寻找其他敏感性、特异性及可靠性较高的早期诊断卵巢癌的肿瘤标志物具有重大意义。真核翻译起始因子4A3 (Eukaryotic translation initiation factor4A isoform 3)是一种RNA结合蛋白(RBP)，是外显子结复合物(EJC)的核心成分 [4] 。其功能复杂而广泛，参与mRNA的剪接、翻译、转运、监测等 [5] [6] ，并且发挥着至关重要的作用，目前一些研究表明EIF4A3在多种肿瘤的发生、发展、癌基因表达、肿瘤细胞侵袭和转移中发挥重要作用，如非小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、结直肠癌等 [7] [8] 。但EIF4A3在卵巢癌中的作用机制尚不明确，因此亟需深入了解EIF4A3在卵巢癌中的作用，旨在为卵巢癌的筛查、诊断、治疗、预后等提供数据参考。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
收集2013年至2018年间青岛大学附属医院收治经过手术治疗的卵巢癌患者57例，交界性卵巢肿瘤20例，因良性疾病切除正常输卵管组织的25例。卵巢癌纳入标准：均为原发性高级别浆液性卵巢癌、且初次手术治疗、术前均未进行放化疗及其他治疗，无其它肿瘤病史。排除标准：已行先期化疗、复发及转移性肿瘤、临床病历资料缺失、随访困难。本研究通过青岛大学附属医院伦理委员会批准。
2.2. 主要试剂
真核翻译起始因子4A3 (EIF4A3)购于美国ABCAM公司。
2.3. 免疫组织化学染色
将每例蜡块置于切片机上切出4 μm厚度薄片，在40℃的水浴箱中将其展平，用载玻片将其捞起，并使其平铺在载玻片中间位置上。放置于切片架上放置在烤箱中烘烤，温度为60℃，时间为1~2小时。在二甲苯溶液及不同浓度的乙醇液中浸泡进行脱蜡、水化，再用PBS缓冲液冲洗，室温下在3%的过氧化氢中孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗2分钟X3次，室温下10%的山羊血清封闭孵育切片组织30分钟，弃去血清，抗体孵育，PBS冲洗，将配置好的DAB显色液均匀滴加于组织切片上进行显色，再用苏木素复染后，放入不同浓度乙醇液中脱水，放入二甲苯中透明后中性树胶封片，在显微镜下观察并拍照分析。
2.4. 免疫组化结果判读
EIF4A3主要表达在细胞核中，以出现棕黄色颗粒和棕褐色颗粒为阳性表达。每张切片随机挑选5个高倍视野(×400倍)，观察视野中阳性细胞所占比例。阳性细胞占总细胞数 < 10%记0分；10%~25%记1分；26%~50%记2分；51%~75%记3分；>75%记4分。染色强度评分：无染色记0分；淡黄色记1分；黄色~黄棕色记2分；棕褐色记3分。阳性细胞数评分与染色强度评分之积为总评分，总评分0分为阴性(−)；1~4分为弱阳性(+)；5~8分为阳性(++)；9~12分为强阳性(+++)。阴性与弱阳性为低表达，阳性与强阳性为高表达。
2.5. 生物信息学分析
通过TIMER数据库中的“Different Expression”模块分析了解EIF4A3在泛癌中的表达水平。通过Sangerbox工具分析EIF4A3表达在泛癌中的预后情况。通过GeneMANIA网站进行共表达基因网络分析与EIF4A3相关信号通路及相互作用蛋白等 [9] 。通过cBioportal网站分析卵巢癌中基因突变情况 [10] 。
2.6. 统计学处理
采用SPSS 27.0统计学软件分析及处理数据，用卡方检验分析EIF4A3在高级别浆液性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤和正常输卵管之间关系，以及EIF4A3的表达与高级别浆液性卵巢癌各临床病理特征之间的关系，采用Kaplan-Meier生存曲线分析法描绘EIF4A3高表达和低表达的曲线，Log-Rank法比较生存率。分析检验标准以P < 0.05提示差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 高级别浆液性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤和正常输卵管组织中EIF4A3阳性表达的比较
高级别浆液性卵巢癌中的EIF4A3阳性率明显高于交界性卵巢肿瘤及正常输卵管组织，P < 0.05，差异具有统计学意义。而交界性卵巢肿瘤中的EIF4A3阳性表达明显高于正常输卵管组织，P < 0.05，差异具有统计学意义(见图1，表1)。
A组为高级别浆液性卵巢癌，上图为(×100倍)，下图为(×400)；B组为交界性卵巢肿瘤，上图为(×100倍)，下图为(×400倍)；C组为正常输卵管组织，上图为(×100倍)，下图为(×400倍)。
Figure 1. Immunohistochemical results showed the expression of EIF4A3 in different tissues
图1. 免疫组化结果显示在不同组织中EIF4A3的表达情况
Table 1. Expression of EIF4A3 in high-grade serous ovarian cancer, borderline ovarian tumor, and normal fallopian tube tissue
表1. EIF4A3在高级别浆液性卵巢癌、交界性卵巢肿瘤、正常输卵管中的表达
注：*为高级别浆液性卵巢癌与交界性卵巢肿瘤组织比较(χ2 = 4.618, P = 0.032)；**为高级别浆液性卵巢癌与正常输卵管组织比较(χ2 = 29.218, P = 0.000)。
3.2. EIF4A3在高级别浆液性卵巢癌各临床病理特征间的关系
EIF4A3表达水平与卵巢癌患者临床分期具有明显统计学差异。EIF4A3在I/II期卵巢癌患者中的表达明显低于III/IV期卵巢癌患者(P < 0.05)。与发病年龄、肿瘤直径、输卵管转移、子宫转移、大网膜转移、肿瘤单(双)侧、淋巴结转移、CA125、HE4、铂敏感、铂耐药均无统计学差异(P > 0.05) (见表2)。
Table 2. Relationship between EIF4A3 expression and clinicopathological features of high-grade serous ovarian cancer
表2. EIF4A3表达与高级别浆液性卵巢癌各临床病理特征间的关系
3.3. EIF4A3高、低表达在高级别浆液性卵巢癌患者中的生存分析
57例高级别浆液性卵巢癌患者在随访中丢失4例，EIF4A3高表达组的5年生存率为30.0%，中位生存年龄为37.9个月，95%置信区间为(28.273, 47.527)。EIF4A3低表达组的5年生存率为52.9%，中位生存年龄为55.9个月，95%置信区间为(41.901, 69.899)。EIF4A3高表达患者总生存率低于其低表达的总生存率(χ2 = 6.314, P = 0.012; P < 0.05) (见图2)。
Figure 2. Kaplan-Meier survival curve analysis
图2. Kaplan-Meier生存曲线分析
3.4. EIF4A3在泛癌中的表达、预后、共表达基因网络图及其在卵巢癌中的突变情况
为了进一步探讨EIF4A3与肿瘤的关系、可能的共表达基因及其在卵巢癌中的突变情况，我们利用生物信息学方法进行了分析和预测。(A) 通过TIMER数据库中的“Different Expression”模块以了解EIF4A3在泛癌中的表达水平，结果显示EIF4A3在12种肿瘤中包括：膀胱癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、直肠腺癌(READ)和胃腺癌(STAD)、子宫内膜癌(UCEC)中均呈现高表达水平。差异具有统计学意义(P < 0.05)。(B) 通过Sangerbox工具另外选取TCGA和GTEx数据库对EIF4A3在泛癌中基因表达的预后分析，发现在10种恶性肿瘤中：GBMLGG (胶质瘤)、LAML (急性髓细胞样白血病)、LUAD (肺腺癌)、KIRP (肾乳头状细胞癌)、KIPAN (混合肾癌)、LIHC (肝细胞癌)、BLCA (膀胱尿路上皮癌)、UVM (葡萄膜黑色素瘤)、ACC (肾上腺皮质癌)、KICH (肾嫌色细胞癌)为高表达预后差，在2种肿瘤中：THYM (胸腺癌)、DLBC (弥漫性大B细胞淋巴瘤)为低表达预后差(见图3)。
通过GeneMANIA网站建立共表达基因网络图，分析EIF4A3相关信号通路及相互作用的蛋白，发现与EIF4A3最有关系的五大基因分别是ETF1 (eukaryotic translation termination factor 1)、CENPX (centromere protein X)、DDX21 (DExD-box helicase 21)、DDX31 (DEAD-BOX helicase 31)和JMJD6 (jumonji domain containing 6, arginine demethylase and lysine hydroxylase)。其中EIF4A3与ETF1存在通路上的联系；DDX21与DDX31存在遗传互作关系；EIF4A3与DDX21、DDX31存在共享蛋白结构域；EIF4A3与DDX31存在共定位关系；ETF1与DDX21存在共定位关系(见图4)。通过cBioportal网站(http://www.cbioportal.org)分析EIF4A3在卵巢癌中的突变情况，选择TCGA和PanCancer Atlas数据集，结果显示21个患者出现上述基因突变，基因突变率为5% (见图5)。
(A)
(B)
注：BLCA：膀胱癌(bladder cancer)、BRCA：乳腺癌(breast cancer)、CHOL：胆管癌(cholangiocarcinoma)、COAD：结肠癌(colon adenocarcinoma)、ESCA：食管癌(esophageal carcinoma)、HNSC：头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)、LIHC：肝细胞癌(liver hepatocellular carcinoma)、LUAD：肺腺癌(lung adenocarcinoma)、LUSC：肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma)、READ：直肠腺癌(rectum adenocarcinoma)、STAD：胃腺癌(stomach adenocarcinoma)和UCEC：子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma)；* < 0.05；** < 0.01；*** < 0.001。
图3. (A) EIF4A3在泛癌中的表达情况；(B) EIF4A3在泛癌中的预后情况
Figure 4. EIF4A3 co-expressed gene network map
图4. EIF4A3共表达基因网络图
Figure 5. Mutations of EIF4A3 in ovarian cancer
图5. EIF4A3在卵巢癌中的突变情况
4. 讨论
卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，其发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌，但死亡率却位居妇科三大恶性肿瘤之首，因其位于盆腔深部，早期临床表现不典型，极缺乏用于早期卵巢癌筛查和诊断的高灵敏性和特异性的生物标记物，导致60%~70%的患者就诊时已处于晚期 [11] ，极大地影响了卵巢癌患者的治疗和预后，且大多数卵巢癌病因尚不明确，无法从病因出发指定有效的预防措施，虽然在过去的几十年里，卵巢癌的手术已经有了长足发展，但卵巢癌的发病率呈逐年上升趋势，且其发现晚，致死率高的特点，严重威胁女性生命健康 [12] ，因此早期诊断具有重大意义，可基于目前现有资料，如CA125、HE4、超声等均不能达到筛查的满意效果，因此需要更积极广泛的探索和研究对早期卵巢癌筛查、诊断敏感、准确的生物标记物，以利于早期预防，以及降低其发病率，提高生存率，实现卵巢癌患者临床获益最大化。
真核翻译起始因子家族成员在恶性肿瘤的发生和发展中起着重要作用，目前发现有3种EIF4A蛋白，EIF4A1和EIF4A2主要在细胞质中，而EIF4A3为核定位蛋白，尽管他们非常相似，但功能却不同 [13] 。真核生物起始因子4A3 (EIF4A3)是DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box家族的三磷酸腺苷(ATP)依赖性RNA解旋酶，是一种核/胞浆穿梭蛋白 [14] 。其由大小大致相同的N端和C端两个结构域组成，每个结构域由七个夹在α螺旋之间的平行链β片组成 [15] 。是外显子结合复合物(EJC)的核心成分，在NMD、mRNA剪接、传输、翻译、监测中发挥着至关重要的作用。结合近年来研究发现EIF4A3在细胞质中的剪接和翻译之间提供联系，是调节细胞周期和细胞凋亡的关键组成部分，与肿瘤相关趋化因子、转录因子信号通路和剪接体信号通路表达密切相关。这些功能决定了EIF4A3在多种恶性肿瘤中促进其发生、发展、侵袭、转移的作用。但EIF4A3在卵巢癌组织中的作用机制尚无研究。本研究发现在高级别浆液性卵巢癌组织中EIF4A3呈明显高表达，显著高于交界性卵巢肿瘤和正常输卵管组织。提示EIF4A3可能参与了高级别浆液性卵巢癌的发生和发展。
本研究进一步分析了EIF4A3与高级别浆液性卵巢癌患者各临床病理特征的相关性，发现在高级别浆液性卵巢癌组织中EIF4A3的表达情况与患者临床分期有关，在III/IV期卵巢癌组织中表达明显高于I/II期卵巢癌组织。与发病年龄、肿瘤直径、输卵管转移、子宫转移、大网膜转移、淋巴结转移、肿瘤单(双)侧、CA125、HE4、铂敏感、铂耐药均无统计学差异。本研究通过绘制Kaplan-Meier生存曲线发现在高级别浆液性卵巢癌中EIF4A3高表达者生存率明显低于低表达者，EIF4A3可能与卵巢癌发生发展和不良预后有关。目前多项研究已经证实EIF4A3参与许多疾病和癌症相关的生物过程，在许多常见和高发病率的恶性肿瘤中过度表达，如肺癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌和中枢神经系统癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌等，且其过度表达与预后不佳有关，特别在肺癌和乳腺癌中 [16] 。一项研究表明：EIF4A3可以通过稳定linc00680和TTN-AS来促进胶质母细胞瘤的发生 [17] 。在多形胶质母细胞瘤中，circMMP9作为一个癌基因，促进多形胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭能力，而EIF4A3可促进其癌基因circMMp9的表达 [8] 。也有研究表明：EIF4A3在肺腺癌组织中高度表达，且促进环LMNB2在肺腺癌中的细胞表达，从而调解肺腺癌细胞的恶性行为方面发挥着致癌作用 [18] 。还有研究表明：EIF4A3通过GSK3B调解TFEB介导的转录反应以控制自噬，以及lncRNACASC11可以通过EIF4A3介导的E2F1激活促进肝癌的进展，且与预后不良有关 [19] 。另一项研究发现EIF4A3在胃癌中高表达，且通过TNF-α/NF-kB信号通路促进胃癌发展，且与肿瘤分期、不良预后有关 [20] 。本研究通过生物信息学发现EIF4A3在多种恶性肿瘤中高表达，且在多种恶性肿瘤中预后差，与我们实验结果一致，综合现有文献、研究及本次实验结果显示EIF4A3可能参与卵巢癌发生、发展的调控。
目前有研究分析发现，通过对EIF4A3在恶性肿瘤中的作用，深入研究其功能和治疗相关性，发现抑制EIF4A3可以防止肿瘤细胞增殖。目前对EIF4A3抑制剂已有少量研究，一项研究发现通过对1,4二酰基哌嗪衍生物通过高通量筛选(HTS)的化学优化，发现了一种具有细胞NMD抑制活性的选择性EIF4A3抑制剂53a [21] 。另一项研究也已确定两种口服选择性EIF4A3抑制剂10和1q [22] 。虽然此项研究处于临床阶段，但是随着进一步的深入研究，揭示EIF4A3的分子机制将为恶性肿瘤治疗提供新的靶点。这也充分说明了EIF4A3在恶性肿瘤发生、发展过程中的重要作用。
目前卵巢癌在早期筛查、诊断方面缺乏可靠的、特异性强的肿瘤标记物，虽然近些年随着不断的探索和研究，卵巢癌治疗方面硕果累累，治疗方式多种多样，包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向药物治疗、激素治疗、中医中药治疗等 [23] [24] ，而靶向药物治疗如PARP抑制剂、抗血管生成药物、免疫制剂等虽是后起之秀，目前在卵巢癌治疗方面也是热火朝天，但是我们清楚靶向治疗并非雪中送炭，而是锦上添花，也不可避免会出现耐药性。因此寻找新的肿瘤标记物、尽早筛查、制定个性化的治疗方案目前已成为国内外的研究热点，EIF4A3的功能复杂而重要，参与多个转录后调节事件，其结构和功能异常直接导致下游生物效应的变化，调解细胞凋亡和细胞周期，促进恶性肿瘤细胞迁移和入侵。我们的研究表明了EIF4A3在卵巢癌中具有诊断和预后价值，但研究具有一定的局限性，病例数量少，未来需要更多病例、更多层次的研究为卵巢癌的临床目的提供深入阐释和证实。
基金项目
江西省卫生健康委科技计划(No：202210969)。
NOTES
*通讯作者。