1. 引言
肿瘤是动物机体在不同的始动和促进因素长期作用下，器官、组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生或凋亡不足而形成的病理性新生物，新生物一旦形成，不会因为病因的消除而停止增生 [1] 。目前，肿瘤疾病是危害人类健康的最重要疾病之一，随着宠物猫数量的增多，肿瘤疾病也是危害猫健康的重要疾病之一 [2] 。猫肿瘤常用的诊断方法有影像学检查、细胞学检查、组织病理学检查、肿瘤标记物早期检查等，但组织病理学检查仍是肿瘤诊断最为有效和可靠的标准 [3] 。耵聍腺位于猫外耳道软骨部皮下组织中，主要是分泌淡黄色黏稠液体，有保护外耳道和维持鼓膜区湿润柔软的作用，其分泌物与外耳道皮肤内的另一种皮脂腺所分泌的皮脂一起组成耵聍 [4] 。耵聍腺由卷曲的分泌部和导管部组成，分泌部内衬立方或低柱状上皮，外围为肌上皮，导管部由柱状上皮组成，绝大部分开口于毛囊，少部分直接开口于皮肤表面，肿瘤主要起源于这两个部分的导管上皮和腺上皮 [5] 。猫外耳道肿瘤在临床上极为少见，对于猫耵聍腺肿瘤的报道也较少。本试验将一例疑似猫耵聍腺肿瘤组织进行病理组织学观察，并对SMA、PCK、Ki-67三个指标进行了免疫组织化学染色，结合临床症状对该肿瘤进行病理学诊断，从而丰富猫外耳道耵聍腺肿瘤的临床资料。
2. 材料与方法
2.1. 病例病史
样本于2018年6月9号收集于武汉卓越动物医院。患病的猫为白色家猫，20岁，雄性，未绝育，体重3公斤。曾在2017年10月14日前往医院就诊时于左耳外耳内可见小的肿块，未做手术治疗，经8个月后肿块数量增多体积增大，遂再次前往医院就诊。治疗采取手术切除的方法，手术采用左耳全外耳摘除术。切下的肿瘤送往华中农业大学动物医学院病理实验室制作蜡块并保存。
2.2. 材料方法
主要试剂：鼠抗PCK单克隆抗体(PCK, PAN-cytokeratin)、鼠抗α-SMA单克隆抗体(α-Smooth muscle actin)，购于武汉博士德生物技术有限公司；鼠抗人Ki-67单克隆抗体及配套免疫组化抗原修复缓冲液，购于基因科技(上海)股份有限公司。HRP标记的羊抗鼠/兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司；封闭液(30%山羊血清)和显色液(DAB)购于武汉博士德生物技术有限公司。
组织经4%多聚甲醛固定，切取多个肿块，乙醇梯梯度脱水，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，分别进行H.E.染色及免疫组织化学染色。
免疫组化染色步骤：将切好备用的4 μm石蜡切片烤片备用，切片经二甲苯、乙醇梯度脱蜡至水，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，封闭内源性过氧化氢酶，0.01M PBS洗涤两次；将PCK、α-SMA玻片放入枸橼酸盐缓冲液中，Ki-67玻片放入稀释的抗原修复缓冲液中，蒸汽热修复，在95℃~100℃之间保持30 min，取出自然冷却；滴加山羊血清白蛋白封闭非特异抗原抗体，封闭30 min后甩掉封闭液，滴加配好的一抗(PCK, α-SMA, Ki-67)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜；PBS洗涤后，滴加反应增强剂室温作用20 min；PBS洗涤后滴加HRP标记的二抗室温作用30 min；PBS洗涤后DAB显色，苏木素衬染，中性树胶封片。使用Nikon 80i生物光学显微镜与图像采集系统观察并采集图像。
3. 结果
3.1. 大体病变
眼观可见肿物堵塞外耳道并伴有出血，增生的肿块约有5~6处，大小从0.5~1.5 cm不等，较大两处肿块呈红棕色，小的肿块呈浅棕色或蓝黑色(见图1)。
3.2. 组织病理学观察
对不同肿块进行切片，H.E.染色，并对组织进行观察，镜下可见三种组织特点：第一种表现在最大的肿块，在组织内可见大量的瘤细胞增生，排列杂乱，不同数量的细胞聚集成多个小叶，组织内血管丰富，并伴有大量炎性细胞浸润(图2A)，高倍镜下可见瘤细胞核大小不一，并出现空泡核，核分裂相多见(图2B)；第二种为浅棕色肿块，同样可见增生的瘤细胞聚成的小叶，但组织内严重出血(图2C)；第三种蓝黑色的肿块为囊状结构，周围为分化良好的单层矮柱状上皮，内部充满分泌物结晶，并有大量的巨噬细胞浸润，巨噬细胞内有色素(图2D)。
3.3. 免疫组织化学试验结果观察
对瘤组织免疫组化染色，大量的瘤细胞PCK均呈阳性表达，着色部位为细胞质(图3A)，说明该增生的
Figure 1. The gross lesion of external auditory canal in the canine (several lumps in the outer ear and blocked with blood clot)
图1. 犬外耳道肿物大体病变(外耳内有数个肿块，堵塞外耳道并伴有出血)
瘤细胞含有角蛋白抗原；α-SMA阳性表达见于瘤组织小叶外覆有的单层或多层束状排列的细胞，着色部位为细胞质(图3B)，说明肿瘤组织内含有平滑肌肌动蛋白抗原。对瘤组织的Ki-67染色可见，瘤细胞所在区域表现出明显的阳性信号(图3C)，阳性率 ≥ 30%，说明大量瘤细胞处于细胞增殖的活跃期，增殖速度快。
4. 讨论
肿瘤的诊断方法主要有肿瘤的巨检、细胞学检查、生化检查、组织病理学检查、影像学诊断、免疫组织化学检查、分子生物学诊断等 [6] [7] 。尽管肿瘤的诊断方法日益进步，但组织病理学检查仍是最常用并最可靠的诊断方法，是肿瘤诊断的金标准。
猫外耳道表面衬有皮肤，是体表皮肤的延生，其内含有毛、皮脂腺和管状的耵聍腺。其外侧部分由软骨支撑，其他部分由骨支撑。耵聍腺为顶浆分泌性腺，是一种变异的大汗腺，所以具有顶浆分泌性腺的特点 [8] 。对于耵聍腺癌的确诊，主要依靠组织学观察结合免疫组织化学技术的方法 [9] 。在临床上，良性的耵聍腺肿瘤在4~13岁的猫中比较常见，最常发生在7~10岁之间，猫的耵聍腺癌比耵聍腺瘤更为多见，其发病高峰在7到13岁之间，家养的短毛猫患病风险较高。耵聍腺癌通常浸润性生长，但很少侵犯
A：大量瘤细胞增生伴有炎性细胞浸润，结缔组织包膜完整；B：瘤细胞大小不一，核多呈空泡状，常见核分裂相；C：大量瘤细胞增生，出血严重；D：大的囊腔内聚集分泌物结晶，可见大量巨噬细胞浸润。H.E
Figure 2. The histological lesion of a mass in the outer ear canal of a cat
图2. 猫外耳道肿块组织学病变
A：肿瘤细胞PCK阳性表达。B：部分肿瘤组织α-SMA阳性表达。C：肿瘤细胞Ki-67表达增强。SABC
Figure 3. Specific antigen expression in tumor tissue
图3. 肿瘤组织特殊抗原表达
或破坏耳道软骨，可能会向腮腺淋巴结转移 [10] [11] [12] 。耵聍腺瘤在耳道内呈肿块状，包括垂直耳道。常见溃疡和继发感染。有些肿瘤是深褐色的，可能是在肿瘤腺体的腔内保留了浓缩的耵聍。本病例为一只年龄20岁的家养短毛猫，肿瘤呈多灶性生长，为典型的肿块状，颜色为蓝黑色或褐色，外观上与耵聍腺瘤(癌)非常相似。在组织学上，耵聍腺瘤与顶浆分泌腺瘤相似，通常有着腺上皮被覆肌上皮的双层结构，腺腔内经常可见棕色球状物质，耵聍腺瘤通常伴有慢性的外耳炎，在镜下往往可以看见炎性细胞浸润。耵聍腺癌在组织学上与耵聍腺瘤相似，但耵聍腺癌通常是浸润性生长，并且瘤细胞的细胞核更大，更多形，核分裂相常见，细胞排列更为杂乱 [10] 。本病例瘤组织周围结缔组织包膜完整，还未表现出明显的强侵袭性，但组织内大量的炎性细胞浸润，大量出血，瘤细胞大量增生，排列紊乱，丧失了耵聍腺的正常结构。细胞核形态多样，核大且多为空泡状，核分裂相多见。免疫组织化学PCK染色可知瘤细胞来源于上皮组织，α-SMA染色可观察到腺上皮外覆有肌上皮，但腺上皮与肌上皮均丧失了原有的单层结构，以腺上皮增生为主。Ki-67染色结果为阳性，阳性率超过30%，说明瘤细胞增殖速度较快。通过临床观察及组织学结合免疫组织化学技术结果，可确诊本猫所患为耵聍腺癌。
本试验使用免疫组化辅助诊断，对广谱细胞角蛋白抗体PAN-cytokeratin(P-CK)与平滑肌肌动蛋白抗体α-smooth muscle actin(α-SMA)进行免疫组织化学染色，以此证明瘤细胞来源于腺上皮，并具有肌上皮覆盖腺上皮的结构。角蛋白(CK)是上皮细胞的主要细胞骨架成分，对上皮细胞有重要的保护作用，它为上皮细胞和组织提供支架从而维持了细胞或组织结构完整性确保了机械耐受性建立了细胞极性，在各种流体静力学压力变化下保护细胞和组织 [13] 。Moll等将细胞角蛋白分成20种，即CK1~CK20细胞分化的不同阶段及不同类型上皮细胞表达不同的细胞角蛋白，上皮组织恶变后，其表达的细胞角白与正常组织基本相同，因此，细胞角蛋白的表达被广泛应用于肿瘤的诊断 [2] 。肌上皮细胞(Myoepithelium, Myoepithelial Cell)位于腺泡和小导管的腺上皮与基膜之间。通常每个腺泡有一个肌上皮细胞，也可以有二三个。免疫荧光、免疫组织化学研究证实肌上皮细胞内含肌动蛋白和肌球蛋白，刺激肌上皮细胞胞可使导管内压力发生变化等，均提示肌上皮细胞有收缩功能，协助腺泡或导管排出分泌物 [14] 。肌动蛋白是细胞中一种重要的蛋白质，是细胞骨架的成分。氨基酸序列分析资料表明，肌动蛋白异型包含两大类主要肌动蛋白：细胞质来源的和肌肉来源的肌动蛋白 [15] 。
本试验对Ki-67进行染色，用于观察细胞增殖速度，以此加强对肿瘤良恶性的判断的准确性。Ki-67作为一个重要的细胞增殖标记物，对很多常见的肿瘤疾病的诊断及预测有重要的帮助，目前广泛的应用于预测各种肿瘤疾病的病情进展 [16] ，Ki-67表达于所有活跃的细胞周期阶段，在细胞核内的定位复杂又有特异性，并随细胞周期改变 [17] 。在细胞周期的G1期及S期早期，Ki-67的表达水平较低，在S期及G2期其表达急剧增加，在M期表达水平达到峰值，随后在细胞分裂后期和末期其表达量迅速下降。Ki-67单克隆抗体标记G1后期S期和G2期M期细胞核抗原，而G0期G1早期的细胞核不被标记，且Ki-67抗原半衰期短，细胞脱离增殖周期后迅速降解这些特点使Ki-67成为优质的细胞增殖标记物 [18] 。
外耳道耵聍腺肿瘤是临床上比较少见的肿瘤，早期确诊尽早治疗至关重要，基本治疗方法为手术及放疗，亦可辅以化疗，根据其严重程度可施行外耳道外侧壁切除术垂直外耳道切除术或全外耳道切除术进行治疗 [5] [19] 。本患猫的肿瘤已阻塞整个外耳道，故医院采用外耳道全切除的方法。将整个外耳道全部切除，不仅切除了肿瘤，也防止了外耳道后期的炎症感染，虽然切除了患侧的耳道可能影响一侧的听力，但另一侧耳道仍能正常发挥作用，并能最大限度的避免肿瘤的复发及转移。
致谢
武汉芭比堂动物医院卓越分院为本试验提供病例。