神经毡蛋白2在神经系统中的相关性研究

Correlation of Neuropilin 2 in the Nervous System

摘要: 本文探讨神经毡蛋白2在神经系统中的相关性研究，通过对国内外公开发表的关于神经毡蛋白2在神经系统相关的文献进行一个系统性综述，得出神经毡蛋白2在神经系统中表达、作用通路等相关知识，从而为相关的神经系统疾病提供新的研究方向并且为治疗提供新的靶点。

Abstract: This article explores the correlation studies of Neuropilin 2 in the nervous system. Through a sys-tematic review of domestic and internationally published literature on Neuropilin 2 in the nervous system, the related knowledge of Neuropilin 2 expression and pathways in the nervous system is derived, in order to provide new research directions for related neurological diseases and new targets for treatment.

1. 引言

神经毡蛋白2 (Neuropilin 2, Npn2)是跨膜糖蛋白，Npn2与Npn1结构相同，其结构域的胞外部分包括两个CUB结构域(a1和a2)，以及两个因子V/VIII同源结构域(b1和b2)，它们与MAM结构域相连，单程跨膜结构域™将细胞外部分连接到具有特征性氨基酸序列SEA的C端PDZ结合结构域基序，以及在MAM和TM结构域之间插入的5个氨基酸(见图1)。脑信号蛋白(Semaphorin, Sema)结合需要a1/a2串联结构域和b1结构域，而血管内皮生长因子(VEGF)结合到b1/b2串联结构域。MAM结构域介导Npn齐聚。Sema家族是一类重要的轴突导向因子，在神经系统发育过程中对神经元及胶质细胞发挥重要的导向作用，Sema3是Sema家族的一个分支，Npn2是Sema3家族和VEGF的共受体，Npn2不仅对神经元的迁移、定位有影响，而且还可以和SEMA3s以及神经丛蛋白(PlexinAs)共同构成全受体复合物，来调节突触的发育、可塑性等，从而对一些中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)的发育及疾病产生影响。

Figure 1. Schematic diagram of neuropilin 2 molecular structure

图1. 神经毡蛋白2分子结构示意图

2. Npn2与神经元的迁移、定位

Sema3F是Sema3家族的一员，具有影响轴突生长、血管生成等作用，参与脑部正常神经环路的形成和完善，Npn2和Sema3F在脑中广泛表达。早前，Gammill等人通过对颅神经的研究发现Npn2/Sema3F信号需要引导颅神经嵴细胞通过鳃弓1和2背侧的颅间充质。该受体/配体对的任何一个成员的缺失导致神经嵴细胞在鳃弓流之间交叉进入通常抑制迁移的区域。Npn2/Sema3F信号传导是头颅神经嵴迁移的模式。Npn2可以作为“停止”信号的一个元素参与其中，该信号告诉三叉神经嵴细胞停止迁移并聚集成神经节 [1]。近年来，有学者通过对小鼠颅骨颅神经嵴细胞(NCCs)不同轴水平的全转录组分析发现，在颅骨颅神经嵴细胞发育的早期阶段Npn2仅限于r1~r2迁移流中的NCC。利用一个可诱导的Cre/LoxP谱系追踪系统，进一步发现表达Nnp2的颅神经干细胞产生r1~r2衍生结构，如三叉神经节。r1~r2衍生的NCC在Npn2基因敲除小鼠中异常迁移表明在神经干细胞迁移的初始阶段，以及在脑神经节分化后控制轴突引导时，需要Npn2来促进迁移到不同的流中，更进一步证明了Npn2在神经嵴迁移中的作用 [2]。简言之，Npn2/Sema3F具有引导颅神经迁移到正确的位置的作用。

Npn2除了对颅神经的迁移有作用外，还对神经元的定位有影响。Teclise Ng等人通过将编码控制Npn2的shNpn2的逆转录病毒注射入6周龄小鼠的海马中，并定量评估了不同时间点(5、10、14、28 dpi)成年出生鼠的神经元的细胞位置。实验表明敲除Npn2导致新生神经元更深入地定位在颗粒细胞层中，新生神经元在齿状回中的细胞定位首先发生在5~10 dpi之间，并且可能随着时间的推移继续缓慢迁移。先前的研究发现Sema3F刺激显着降低糖原合酶激酶3 (GSK3β)的丝氨酸磷酸化从而激活了GSK3β，那么它的激活是否依赖Npn2的存在，实验证明在表达Npn2 shRNA的细胞中，GSK3β的丝氨酸磷酸化增加了，而敲除GSK3β新生神经元表现为Npn2介导的细胞定位缺陷，证实GSK3β是Sema3F-Npn2途径的下游分子，可能在Npn2下游特异性地调节细胞定位 [3]。

此外，还有学者利用轴突靶向的转基因小鼠来观察背侧中间神经元dI1和dI4连合轴突，发现Npn2在dI1上有选择性的表达，而不是dl4。利用腹连合轴突标记的抗鼠GAD65来评估Sema3-Npn2信号在不同轴突通路中的作用，发现dI1需要Npn2在腹中线的对侧导航，以及在体外通过Sema3介导生长锥塌陷。总之，这些发现表明Npn2以一种亚型特异的方式调节对侧连合投射的通路 [4]。随后，针对轴突导向，有学者通过建立延时成像技术监测鸡胚脊髓中连接轴突中的受体以及通过荧光分析生长锥在时间推移序列中的位置，观察到Npn2从交叉前阶段暴露在连合生长锥表面，并在底板交叉上保持表达，PlexinA1聚集在生长锥前部，Robo1在后部，而Robo2在生长锥的表达是均匀的，它们在连续的导航步骤中装备连合生长锥，PlexinA1/Npn2介导的Sema3B和PlexinA1介导的SlitC活性可在底板进入时启动，Robo1介导的SlitN信号在中线后开始，Robo2介导的信号在下一个交叉后选择点开始。通过这种机制，连合生长锥在脊髓导航过程中以精确的时间功能对指导信号进行功能化 [5]。

众所周知，Npn2是Sema3家族和VEGF的共受体。Sema3A和Sema3F下调、Npn1和Npn2的上调与周围神经损伤的再生有关，这些因子主要在损伤远端的施旺细胞中表达。有学者通过对背根切断大鼠用放射性标记的SEMA3F和Npn2反义探针标记检测发现Sema3F表现为下调，而Npn2则表现为明显上调，VEGF mRNA也是显著上调，而且Npn2 mRNA的上调与VEGF的上调时间一致。而Sema3A mRNA在同一时间被迅速下调。这可能意味着VEGF和Sema3A在背根损伤模型系统中存在相互作用，并且可能与Npn2竞争性结合。该实验结果提示Npn2可能通过VEGF和SEMA家族对轴突生长有作用 [6]。无独有偶，Malik在其文章中也提到在神经损伤后1周神经元标志物的表达增加。在Npn2基因，Npn2的表达中也观察到了相同的结果。Npn2对Sema家族的成员选择性做出反应，分泌蛋白指导神经元迁移。在发育中轴突生长锥对其适当的靶组织有明显的诱导作用。在挤压部位和远端啮齿动物神经残端的雪旺细胞中，在信使核糖核酸(Mrna)水平上Npn2有明显的诱导作用 [7]。还有一项对周围神经再生和失神经支配后VEGF的表达研究，他们对大鼠正中神经的神经损伤模型(挤压损伤、端到端修复和神经退行性变)进行VEGF生物分子和免疫组化分析发现，当退行性变时VEGF共受体Npn2显著上调，Npn2可以结合VEGF165，而VEGF165刺激增加雪旺细胞的迁移，这是促进轴突生长的主要过程。这提示Npn2与VEGF165结合在轴突生长和神经引导方面具有重要作用 [8]。

Npn2与神经的迁移、定位以及轴突导向生长有关，而学习和记忆功能可能与这些新生神经元的定位、导向有关。神经元定位、导向错误可能会导致严重的认知和情感缺陷，从而引起孤独症谱系障碍(ASD)、精神分裂症等中枢神经系统疾病。

3. Npn2与突触的发育、可塑性

Npn2除了对神经元的定位、轴突导向有关外，还与突触的发育和可塑性的相关。Sema3G能够调节突触可塑性和海马依赖性记忆，与Npn2共同定位于齿状回、门区和CA1和CA3区的锥体层，神经丛蛋白(PlexinAs)是Sema3s和Npn的共受体，为明确Sema3G对突触的作用是否与Npn2和PlexinA4有关，有学者通过用shRNA敲除CA1锥体神经元Npn2，进行大鼠原代海马神经元体外培养，对突触前和突触后标记后进行免疫染色，并且将shRNA特异性定位于PlexinA4，同样进行固定免疫染色，结果显示Sema3G介导的突触密度减少，表明Sema3G促进突触前和突触后结构的组装，并以Npn2依赖的方式增加兴奋性突触密度，通过突触后Npn2/PlexinA4信号调节兴奋性突触传递。既往的研究表明Rac1 (与Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1)在树突状脊柱的形成和神经元细胞骨架的重排中具有作用，为了明确Rac1是否是Sema3G-Npn2/PlexinA4信号通路的下游分子，研究者们将海马神经元与Rac1特异抑制剂共同培养，结果显示Sema3G诱导的兴奋性突触密度增加的作用被阻止，这些结果告诉我们Sema3G通过Npn2/PlexinA4信号激活Rac1增加兴奋性突触密度，从而调节突触可塑性和海马依赖性记忆 [9]。

我们知道，正确的认知功能依赖于海马区精细的突触结构和突触可塑性，而阿尔兹海默症(AD)患者Sema3G水平显著降低，我们有理由提出树突棘丢失和功能障碍是导致AD认知能力下降和记忆丧失的原因，此外，锥体神经元棘丢失也常见于精神分裂症。因此，确定刺激Sema3G-Npn2信号通路是否对维持正常的突触可塑性和认知行为是否具有临床意义值得更深入研究。

除了PlexinA4，还有学者对PlexinA3与Sema3s和Npn2对突触的作用进行了研究。Sema3F可能通过与突触后位点的全受体相互作用，介导其在稳态可塑性中的作用，他们的研究就是对这一推论进行了验证。已经证实了Npn2的表达集中在皮层神经元的树突棘上，并与GluA1点共同定位，通过其立方结构域与GluA1特异性相互作用。该研究结果显示，Npn2基因敲除神经元的微小兴奋性突触后电流振幅减弱，证实了Npn2在介导神经元活动性突触强度降低中的重要作用。荷包牡丹碱可以引起皮层神经元活性增加从而促进Sema3F分泌以及表面AMPA受体缩小。在Npn2−/−皮层神经元中，荷包牡丹碱引起的表面GluA1的减少被消除，这表明神经元活动引起的AMPA受体的缩小需要Sema3F/Npn2/GluA1信号。Sema3F全受体的另一个亚单位PlexinA3不直接与GluA1相互作用，而是由Npn2促进Npn2/PlexinA3/GluA1受体复合物的形成。这项研究的成果共同表明，增加的神经元活性通过增强其全受体Npn2/PlexinA3介导的Sema3F的分泌发挥作用触发AMPA受体的缩小，实现了稳态标度。Npn2/PlexinA3全受体的Sema3F依赖性调控具有双重功能，Npn2是调控AMPA受体表达的交通机械的核心组成部分，而PlexinA3在Ras失活后促进信号级联。在中枢神经系统(CNS)中，神经元可以通过稳态标度维持其放电速率，允许神经元在保持突触连接相对强度的同时保持平衡、优化的放电速率，从而控制整体神经网络稳态 [10] [11]。

此后，维什瓦·莫汉等学者通过研究发现皮层锥体神经元的神经胶质相关细胞粘附分子(NrCAM)通过Sema3F及其Npn2/PlexinA3受体复合物的信号转导通路对树突棘的密度具有调控作用。NrCAM是免疫球蛋白类识别分子L1家族的一员，在粘附、轴突生长和突触靶向中具有不同的作用。先前已经有研究证明NrCAM缺失小鼠表现出与孤独症相关的社交能力受损、反向学习和感觉加工行为。在分子模拟的指导下，发现了NrCAM通过诱导Sema3F全受体复合物的膜聚簇/齐聚，在促进棘突修剪发育中具有新的作用。受体聚集是通过NrCAM-Ig1和Npn2-a1胞外结构域之间的结合介导的，还需要PDZ结合基序与未成熟的突触支架蛋白SAP102结合参与Sema3F诱导的受体聚集和棘突收缩。其结果也证明NrCAM和神经丛蛋白a3是Sema3F介导的β1整合素失活导致棘突消除所必需的。Sema3F诱导的β1整合素失活是棘突回缩的初始步骤。NrCAM-Ig1与Npn2-a1的结合，加上胞质PDZ支架的相互作用，稳定了Npn2-PlexinA3的结合，使Sema3F二聚体更有效地形成一个活性的全受体信号复合物。出生后发育中的锥体神经元中NrCAM的缺失会增加锥体神经元中兴奋性突触的数量，可能会增强大脑皮层的兴奋性。通过NrCAM和Sema3F可能与包括钙粘蛋白在内的其他粘附分子合作完成发育性棘突修剪，调节棘突形态发生和动力学的不同方面 [12]。

近来，研究发现除了NrCAM，L1家族细胞粘附分子L1 (CHL1)通过信号蛋白3B (Sema3B)在发育中的皮层锥体神经元中诱导树突棘剪枝。CHL1对皮质网络的正常发育很重要，因为CHL1缺失小鼠显示工作记忆、社交能力、感觉门控和注意力的皮质功能受损。通过电镜及电生理等研究发现CHL1和Sema3B在发育中的小鼠大脑皮层消除锥体神经元上的树突棘。CHL1与Sema3受体亚单位Npn2和丛蛋白a4形成突触–神经小体复合物，并在皮层神经元培养物的顶端树突上介导棘突清除反应，从而来限制棘突密度。棘突的形成和收缩有助于发育和成熟大脑皮层网络的重塑和微调。已经证实了人类CHL1/CALL基因(3p26.3)的遗传变异与ASD、精神分裂症和智力残疾的认知功能障碍有关 [13]。因此，该研究揭示了发育性棘突重塑的正常分子机制，可能为某些神经发育性疾病(脑性瘫痪、先天性脑积水)的棘突发育不全提供了线索。

早前已经证明Npn2对神经元的定位、锥体细胞突触后GABA能突触装置的发育有影响。采用免疫细胞化学和Nissl染色方法来标记和计数敲除Sema3F的海马内不同的兴奋性和抑制性神经元群，发现海马各区域的GABA能中间神经元数量、轴突生长和突触数量都显著减少，表明Sema3F调节锥体神经元中超氧化物合成/降解速率可能间接或直接调节GABA能突触的蛋白质含量。同时，Sema3F特异性基因敲除小鼠还表现出社交行为的减少和重复行为/限制性兴趣的增加。Sema3F-Npn2信号通路的改变导致功能性突触连接性、癫痫/反复发作以及自闭症样行为的改变等共病倾向的改变，增加了癫痫易感性和孤独症行为。此外，该研究还提出，Sema3F-Npn2除了对GABA能神经元有作用外，可能还具有其他细胞内靶点，如酪氨酸受体激酶或其下游信号通路(mTOR通路、PI3激酶信号通路)，这些通路在神经系统中也有表达，所以Sema3F-Npn2信号通路对癫痫和孤独症是否是通过GABA能神经元和这些通路共同作用值得更深入研究 [14]。

通过使用Npn2敲除小鼠研究发现Npn2信号通路在活体中对皮质神经元棘突密度、皮质传递和功能的发育和维持是必需的，Npn2的丢失扰乱了皮质传递，增加了单核苷酸多态性(SPNs)的兴奋性和棘突的密度，并损害了目标导向行为。此外，在成年动物第五层皮质神经元中Npn2的选择性缺失增加了这些神经元顶端树突的棘突密度，改变了皮质–纹状体的可塑性，并损害了运动技能的学习 [15]。总的来说，该研究为更好地理解神经发育疾病包括孤独症谱系障碍、精神分裂症、脆性X综合征和智力低下等的机制提供了新的见解。

突触形成和稳定过程的紊乱是ASDs病因学的一个基本特征。而Npn2在中枢神经系统中具有引导轴突和控制神经元迁移的作用。国外的学者通过病例对照分析研究发现编码Npn2的人类基因组2q34区的单核苷酸多态性与自闭症有关，Npn2基因多态性等位基因与孤独症相关 [16]。

还有学者使用Npn2敲除小鼠模型来评估Npn2的缺陷对行为性惊厥、海马兴奋性、神经元细胞类型/数目、超微结构形态(突起长度和复杂性以及树突棘型和数目)和突触蛋白含量的结果。其结果强烈地表明，发育过程中Npn2的缺失严重影响海马神经元间的迁移和分化，并有下游影响，Npn2缺陷小鼠的癫痫发作阈值降低，对癫痫易感性和海马神经网络兴奋性产生负面影响 [17]。该研究结果进一步证明了Npn2通过突触对中枢神经系统疾病的影响。

除了研究Npn2对孤独症和癫痫的影响外，有学者通过对360名注意力缺陷多动障碍(ADHD)先证者、21名受影响的兄弟姐妹和17名未受影响的兄弟姐妹共398名青年的血管生成、神经营养等SNP调节出生体重和ADHD的关系进行研究发现，Npn2和Npn1的单核苷酸多态性与出生体重百分位数相关，可以预测多动性冲动症状的严重程度。原因是Npn1和Npn2在中枢神经系统和内皮细胞中表达，并在血管发育和轴突引导中发挥重要作用。当脑缺血缺氧后，NRP1、2破坏了缺血区附近的轴突引导，而神经元的迁移和轴突引导与ADHD的发展和外化行为问题有关 [18]。

有学者通过对帕金森患者行DBS手术后对其血浆生物标志物的蛋白质组学和生物信息学研究发现，在行DBS术后，Npn2表达上调，而DHH的表达下调，该研究发现新的有高度特异性和敏感性的帕金森病的生物标志物，有助于早期诊断和治疗帕金森病 [19]。

除此之外，还有一项比较有趣的研究。先前的研究已经告诉我们Npn2介导嗅感觉神经元(初级神经元)靶向小鼠后腹侧主嗅球(PV-MOB)。对于有吸引力的社会反应，在OB的后腹侧(PV)部分发现有反应的神经纤维球。内侧杏仁核(MeA)对气味输入做出有吸引力的反应。在这一研究中，研究者提出一种僧帽细胞(MCs)，它是一个二级神经元。他们通过使用荧光标签，发现Npn2⁺ MC将其轴突发送到MeA的前部。利用逆行病毒追踪显示PV-MOB中的Npn2⁺ MC确实与MeA神经元形成了突触。证明，Npn2对于MOB和MeA之间的电路形成有指导作用，将有吸引性的社会信号MOB传递到MeA，从而产生有吸引力的社会反应，而在MC特异性Npn2基因敲除小鼠中，Npn2-MCs的电路形成和气味诱导的吸引性社会反应受损。而且实验中他们惊喜地发现单个Npn2基因的激活就足以指导其神经回路的形成。更进一步向我们证明了对于吸引人的社会反应，Npn2是一个关键的决定因素 [20]。

现已证明，Wnt/β-连环蛋白通路通过参与调节神经的发生和死亡等来参与癫痫发作的进展 [21]。上文我们已经提到Npn2在癫痫发生中的作用，那么Npn2和Wnt通路在癫痫中是否有联合作用，斯蒂芬研究的关于Npn2在肿瘤中的作用或许能够给我们一些提示。这篇文章中指出，Npn2是Hedgehog (HH)信号通路的重要阳性调节因子，对血管生成有重要作用。此外，Npns还通过HH信号影响其他信号通路的活性，如Wnt/β-catenin、Notch和TGF-β。目前针对Npn2的研究主要集中在肿瘤方面。多位学者通过实验证明突变型p53蛋白、miR-331-3p、miR-15b、miR-486-5p等通过对Npn2表达的调控从而影响肿瘤的生长、转移 [22] [23] [24]。而针对TGF-β与Npn2的关系，研究发现TGF-β诱导的内皮-间质转化与miRNA27介导的Sema受体(Npn2、丛蛋白A2及从蛋白D1)活性改变有关 [25]。有学者研究发现，在乳腺癌细胞中VEGF-Npn2信号通过YAP/TAZ介导调节Rad51，这一发现将侵袭性乳腺肿瘤对VEGF-Npn2信号的依赖性、YAP/TAZ的过度激活和高Rad51表达整合到一个统一的机制中，解释了该病治疗抵抗的可能机制，从而为乳腺癌化疗药物如顺铂的药物抵抗提供新的解决方法 [26]。通过对血液恶性肿瘤及小肠神经内分泌肿瘤患者的生物标志物检测发现，Npn2呈现高表达水平，提示在这些肿瘤中，Npn2可能是有价值的生物标志物或潜在的治疗靶点 [27] [28]。Npn2除了参与肿瘤的侵袭和转移外，还可能是肿瘤特异性死亡的独立预后标志物 [29]。对于免疫性疾病，Npn2主要通过减少淋巴管生成VEGFR-3/Npn2受体信号传导阻碍淋巴管生成而发挥作用 [30]。那么，Npn2在肿瘤、免疫系统中的作用及涉及的相关通路等是否在神经系统疾病中也有类似的作用值得更深入的研究。

4. 结论

神经系统疾病的病因涉及遗传、基因突变、感染、肿瘤、免疫等诸多因素，Npn2作为Sema家族的受体，在海马主要神经元发育过程中神经元的定位、迁移、控制树突和棘突发育、兴奋性突触形成、和兴奋性神经传递具有重要作用，其基因多态性与孤独症、注意力缺陷多动障碍、癫痫、智力发育障碍、脑性瘫痪、周围神经退行性变等神经系统疾病相关。相信经过不断研究，Npn2与神经系统疾病相关的病理生理学、基因机制、分子机制的神秘面纱将被逐渐揭开，从而为神经系统疾病的诊断及治疗的研究提供新的思路和方向，最终为患者带来福音。