microRNA-PUMA信号通路在非肿瘤性疾病中的研究进展

Research Progress in the Regulation of Puma Expression by microRNA in Non-Neoplastic Diseases

摘要: p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis, PUMA)在许多疾病的发生发展中发挥着至关重要的作用，其调控机制主要为转录水平的调控(p53依赖/非依赖途径)及翻译后磷酸化调控机制，相关microRNA-PUMA信号通路的发现，不仅为肿瘤性疾病的治疗提供了新依据，也为许多非肿瘤性疾病的治疗提供了新思路，如老年性急性心肌梗死、心脏瓣膜病、神经元退行性变、血脑屏障等疾病近年来有了新的突破，甚至有望成为疾病新的预测分子。本文主要从microRNA-PUMA相关通路的发现就近年来在非肿瘤性疾病中的研究作一综述。

Abstract: p53 up-regulated modulator of apoptosis (PUMA) plays an important role in the development of many diseases. Its regulatory mechanisms include transcriptional regulation (p53-dependent/ non-dependent pathway) and post-translational phosphorylation. The discovery of related microRNA-PUMa signaling pathway not only provides a new basis for the treatment of neoplastic diseases, but also provides a new idea for the treatment of many non-neoplastic diseases: for example, senile acute myocardial infarction, heart valvular disease, neuronal degeneration, blood-brain barrier and other diseases have made new breakthroughs in recent years, and are even expected to become new predictive molecules of diseases. In this paper, the findings of microRNA-PUMA related pathways in non-neoplastic diseases in recent years are reviewed.

1. 引言

PUMA属于BH3-only家族，为Bcl-2家族成员之一 [1]，可以通过p53依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡，对于细胞程序性调控乃至体内环境稳态的维持起着十分重要的作用。microRNA为一类非编码RNA，分子量大小不等，microRNA可以靶向作用mRNA以阻止翻译或者降解mRNA达到阻止目标分子的形成。生物信息学分析发现PUMA是相关微小RNA (microRNA, miRNA)的潜在靶基因，但是其中的通路众多，机制极其复杂。早在2010年张春智 [2] 等研究发现，在U251人脑胶质瘤细胞中转染反义minR-221/222后PUMA含量明显增加，而抗凋亡蛋白BCL-2却明显下降，促进人脑胶质瘤细胞凋亡以达到抑制肿瘤的作用。而Liu [3] 等研究发现，在转染miR-222抑制剂的肝癌细胞株(HepG2)中上调了PUMA的表达，换而言之，miR-222的表达会下调PUMA的含量降低肝癌细胞的凋亡，达到促进肝癌细胞的生长，为肿瘤性疾病的治疗开辟了新途径。随着众多学者研究的深入，发现microRNA-PUMA信号通路在肺肿瘤性疾病中也起着十分重要的作用，这其中包括miR-222/221/222-3p/183-3p与PUMA等信号通路在相关性疾病中得到研究证实，因此本文将就microRNA-PUMA信号通路在非肿瘤性疾病中的关系就近年来的研究作一综述。

2. PUMA结构与功能

PUMA基因最早是于2001年被发现，该基因具有极其强大的促凋亡能力，因此其编码的产物命名为PUMA即p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis protein, PUMA)，为p53基因转录而来，但可以受非p53通路调节 [4]。PUMA的编码产物包括PUMAα、β、γ、δ。Pumaγ、δ不具有BH3结构而不具有诱导凋亡功能。哺乳动物的细胞凋亡途径主要有bcl-2途径 [3]。bcl-2家族根据其细胞结构、功能可以被划分为抗凋亡效应蛋白、凋亡效应蛋白和只包含BH-3结构域的3个亚型，这3个亚型在执行细胞凋亡中各自的作用和功能不同 [5]。PUMA则为仅含BH-3结构域的促凋亡蛋白，可以通过p53依赖途径/非p53依赖途径介导细胞凋亡，但最终引发的下游级联反应通路是相同的。其具体途径为：1) 结合：在PUMA的第141~149位氨基酸形成了能于BH1、BH2、BH3结构域上的疏水凹槽相结合的α-螺旋结构，结合后一是能解除BCL-2的抑制作用，其次是能直接激活凋亡效应蛋白Bax [6]。2) 定位：PUMA的发挥凋亡功能的前提便是正确定位于线粒体，否则将丧失凋亡活性，PUMA的定位功能依赖其C末端的第151~193位氨基酸序列 [7]。3) 活化及释放调完因子：在结合步骤时即可发挥活化凋亡效应蛋白Bax/Bak、Bax、Bak在线粒体外膜中正确定位，形成特殊的离子通道而大大增加了线粒体膜的通透性，进而线粒体中释放出凋亡前体分子如：细胞色素C、Smac/DIABLO等进入细胞质中发挥凋亡作用 [8]。

3. microRNA结构与功能

microRNA是一类长度约22个核苷酸左右的非编码单链RNA分子，之所以其分子长度可有所变化是因其3'端PolyA尾结构上可有1~2个碱基变化。microRNA广泛存在于真核生物中，也存在于植物细胞中 [9]。microRNA的形成需要经历转录、加工、转运、剪切四个过程。具体过程如下：1) 转录：在RNA聚合酶II的诱导下，microRNA基因转录生成microRNA前体(pri-microRNA)，此时所新成的核苷酸序列在成千以上；2) 加工：在RNaseIII核酸内切酶及其DGCR8蛋白形成的复合体的作用下将pri-microRNA加工成长度约70~100个核苷酸序列的pri-microRNA [10]。以上两个步骤均在哺乳动物细胞核内完成；3) 转运：长度约70~100个核苷酸序列的pri-microRNA在RNA蛋白–三磷酸鸟苷结合物(RAN-GTP)和exportin-5转运至细胞质内，此步骤需消耗GTP；4) 剪切：在细胞质内，pri-microRNA经核酸酶Dicer剪切、解旋酶解旋、降解形成成熟的microRNA。截止目前研究发现microRNA阻止MRNA或者降解MRNA有三种途径：1) microRNA与mRNA碱基不完全配对，形成不完全互补结合以抑制mRNA翻译过程，对于mRNA的稳定性无影响。2) microRNA于靶mRNA完全互补结合，mRNA被完全降解。3) microRNA于靶mRNA仍是完全互补结合的方式，但是结局是靶向切割mRNA，形成不同分子大小的核苷酸片段。据统计，microRNA可以调控超60%的蛋白编码基因 [11]。

4. PUMA与microRNA

正如前面所述，microRNA其主要作用就是通过靶向结合mRNA上的3'-非翻译区(3'-UTR)阻止或者降解mRNA，从而阻断翻译目标分子的形成。早在2008年，Choy [12] 等研究发现，PUMA是mir-BART5的靶点，PUMA上的3'-UTR上存在mir-BART5的调节区以靶向调节PUMA蛋白的表达达到抵抗凋亡的作用，为疾病的发生、发展及药物研发提供了新途径，因此本文就近年来关于microRNA-PUMA信号通路在非肿瘤性疾病中的研究进展作一综述。

5. microRNA-PUMA信号通路与非肿瘤性疾病

5.1. 心血管疾病

心血管疾病是一组复杂、高危的临床性疾病，心肌细胞的缺血、再灌注损伤、心力衰竭致使心脏的结构与功能受损。李春燕 [13] 等研究发现，在构建的缺氧诱导的人心肌细胞(Human cardiomyocyte, HCM)中，成功转染miR-370抑制剂后，利用MTT和Annexin V/PI检测细胞凋亡试验表明，miR-370低表达可显著降低HCM的凋亡率(P < 0.05，与单纯缺氧的心肌细胞相比)。进一步检测研究发现，在过表达miR-370的HCM中，Western blot检测发现制p-PI3K、p-AKT的表达均受到抑制(P < 0.05，与单纯缺氧的心肌细胞相比)。虽然该实验没有直接检测PUMA蛋白的表达量，但是间接说明了miR-370在心肌细胞受损时可影响心肌细胞的凋亡，且PI3K-AKT信号通路与PUMA的表达密切相关。因此后续试验可以加测PUMA蛋白的检测。尹波 [14] 等研究发现，在心脏瓣膜性疾病中，病变部位较周围健康的心脏瓣膜组织中PUMA的含量明显升高。为了进一步探索PUMA的相关信号通路，该研究将miRNA抑制剂转染至心脏瓣膜细胞中，发现miR-15a的含量明显低于对照组(P < 0.05)，然后利用Western blot检测发现PUMA蛋白水平明显上升(P < 0.05)。因此在心肌细胞通过上调miR-15a的表达，可以降低心肌细胞损伤，减少或是延缓心脏疾病的发生、发展。Yin [15] 等用免疫印迹法检测老年急性心肌梗死患者(Acute myocardial infarction, AMI)、不稳定性心绞痛(unstable angina、UA)和健康老年人血清中miR-214的表达水平分别为15.79 ± 4.66、4.60 ± 2.51、2.07 ± 0.99，各组间比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。然后利用H₂O₂具有诱导凋亡的作用去处理HCM，接着转染miR-214模拟物，发现HCM凋亡率明显低于阴性对照组(P < 0.05)，也就是证明了miR-214可以抑制PUMA的表达，进一步以western blot检测miR-214表达对HCM中PUMA的影响，发现PUMA的含量下调63.64% (P < 0.05)。近年来，众多的研究发现miRNA/PUMA轴在心血管疾病起着重要作用，甚至有望可以成为新型标记物作为心血管类疾病的预测分子。

5.2. 糖尿病

1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病，越来越多的证实T1D的发生、发展与miRNA、凋亡分子密切相关。Tian [16] 等选取了48只小鼠将其分为对照组和观察组，观察组连续5天向小鼠腹腔内注射链脲佐菌素成功诱导T1D模型。该实验以RT-qPCR技术检测T1D组小鼠脾细胞和胰岛细胞显示miR-150表达下调(P < 0.05，与对照组相比)。同时利用芯片试验验证了NF-kB P65能与miR-150启动子结合，抗NF-kB P65探针细胞对miR-150的富集最用最强，因此NF-kB的高表达能够增强miR-150的表达上调。而该实验的双荧光素酶报告基因分析结果也表明PUMA是miR-150的靶基因，miR-150可以通过抑制PUMA抑制T1D诱导的炎症和β细胞凋亡。Guo [17] 等分别选取了T1D、T2D和健康对照组78、46、56例，同样以RT-qPCR技术检测上述三组的外周血单核细胞中miRNA的表达水平，发现miR-150在T1D中的表达水平低于T2D及健康对照组(P < 0.05)，这两者的研究结果是一致的，也充分说明了T1D的发生与miR-150、PUMA的表达是密切相关的。

5.3. 非酒精性脂肪肝病

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)为一种多因素作用下的肝细胞脂肪样变性和肝细质胞内脂贮积为特征临床病理疾病。Cazanave [18] 等研究发现miR-296-5p可以在NAFLD中靶向调节PUMA，首先他们利用计算机分析发现PUMA mRNA的3'-UTR中存在miR-296-5p的两个结合位点，在增强miR-296-5p的表达后可明显减低肝细胞中PUMA蛋白的含量，反之，PUMA蛋白含量明显升高，即PUMA mRNA的表达与miR-296-5p呈负相关(person相关，r = 0.30，P < 0.05)，同样基因检测也证实了PUMA 3'-UTR是miR-296-5p的直接靶点，该实验还证实了PUMA mRNA是miR-296-5p的直接靶点。Yang [19] 研究发现miR-29α在NAFLD细胞中过表达后可以减少IL-6的表达从而减轻了肝脏损伤的炎症程度，但是该研究并未检测PUMA含量的变化。在NAFLD中有众多microRNA参与其发生、发展，但是目前为止microRNA-PUMA信号通路在此疾病中的相关研究甚少。

5.4. 神经元退行性病变

在暴露于电离辐射或接受放射治疗的患者，一般较正常人更容易发展为痴呆症，或是其记忆及神经缺陷性疾病。Boris [20] 等研究发现，在雄性小鼠接受10Gy剂量的照射后的30 min时miR-23a-3p水平迅速下降，而自6 h后PUMA的表达明显上调，同样miR-23a-3p也是以其中一条链与Argonaute (AGO)蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体来降解PUMA mRNA，因此开发miR-23a-3p类似物以抑制神经元细胞凋亡治疗神经元性疾病将成为新靶点。Sabirzhanov [21] 等研究发现miR-711也可以间接调节PUMA的含量在神经元性疾病中的抗凋亡作用，本实验选取以3个月大的雄性小鼠作为研究对象，以CCI和依托泊诱导的神经细胞损伤中，发现miR-711是呈明显上调，表现为miR-711上调抑制Ang-1，而Ang-1能增加AKT的活性，即以miR-711/Ang-1/AKT/PUMA通路发挥抗凋亡作用，同样miR-711也是以RISC沉默复合体来靶向切割或是降解Ang-1 mRNA实现其含量下调。且在该试验利用萤火虫荧光素酶基因Ang-1的3'UTR插入到pmirGLO质粒(pmir-Ang-1)中，转染miR-711后24 h，转染pmirAng-1的细胞荧光素酶活性降低，但未见阴性对照miR模拟物。这些结果表明miR-711靶向Ang-1mRNA的3'-UTR，并抑制Ang-1的表达从而达到抑制PUMA的上调抑制神经元细胞凋亡。Qazi [22] 等研究发现miR-132/SIRT1/p53/PUMA通路在神经元性疾病中同样发挥着极其重要的作用，该实验成功构建了以2.5 mm的MPP+处理的中脑细胞建立了帕金森病(PD)模型。用qRT-PCR检测发现miR-132呈时间剂量依赖模型，紧接着利用双荧光素酶分析，miR-132靶向组蛋白去乙酰化SIRT1 3'UTR，使其活性降低致使p53乙酰化增加导致PUMA含量表达增加，诱导细胞凋亡。

5.5. 脑血管疾病

脑血管疾病是众多疾病中发病率和致残率最高的疾病之一，其机制众多，主要包括神经细胞的凋亡、血脑屏障的损伤、炎性损伤等。随着对该类系统疾病的深入研究发现PUMA、miRNA在维护血脑屏障的完整性、神经细胞的损伤方面发挥着十分重要的作用。白莹 [23] 等研究发现，利用甲基苯丙胺诱导血脑屏障细胞损伤后，沉默miR-143基因能够减轻甲基苯丙胺诱导的血脑屏障的损伤作用，然后在人脑微血管内皮细胞上分别转染miR-143、Anti-miR-143慢病毒、过表达PUMA、PUMA-siRNA慢病毒后，发现NF-κB、p53的含量分别为下调、上调、上调、下调。而甲基苯丙胺又可以作用于Sigma-1受体从而激活PI3K/AKT信号通路，在前文已经阐述，PI3K/AKT信号通路的激活促进了STAT3的转核作用，从而上调miR-143的含量以达到抑制PUMA的表达。进一步探讨PUMA与紧密连接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)两者之间的关系，在转染PUMAsiRN慢病毒的人脑微血管脑细胞中ZO-1水平明显下降(P < 0.05)，ZO-1水平的下降减低血脑屏障的完整性，从而致使相关疾病的发生，这也是第一次证实了miR-143/PUMA在维持血脑屏障完整性中的作用，为药物成瘾引起的血脑屏障损伤的治疗提供了新思路。Zhang [24] 等人研究发现在PUMA KO小鼠的视网膜内皮细胞数量显著减少，间接反映了PUMA在减低血脑屏障的稳定性。但是在Yan [25] 等研究发现PUMA能抑制蛛网膜下腔内皮细胞凋亡以维持血脑屏障的完整性，这与上述研究结果是相反的。作者认为是PUMA在不同的信号通路和不同的微环境中，PUMA所起到的作用是不尽相同的。Liu [26] 等研究发现在缺血性卒中的大鼠(I/R模型)的脑组织中，利用TTC染色法检测发现miR-211模拟物可明显较少脑组织的梗死体积，而在抗miR-211治疗后，脑组织梗死的体积明显增大(P < 0.05，单因素方差分析)。为了进一步探究miR-211是以何种途径保护神经元细胞，用Western blot检测了PUMA在抗miR-211处理组及miR-211模拟组中的PC12细胞中的表达，结果表明，模拟组中PUMA含量下降而抗miR-211组细胞中PUMA含量是明显升高的。然后在I/R诱导损伤前的24小时，将PcDNA.3-PUMA和miR-211模拟物质粒转染到PC12细胞中，PUMA的表达恢复，在I/R处理前24小时将PUMAsiRNA和抗miR-211共转染PC12细胞后PUMA含量上升且抵抗了miR-211模拟物的凋亡抑制作用，因此miR-211过表达下调PUMA以减少PC12细胞的凋亡。Sabirzhanov [27] 还发现了miR-711同样可以靶向PUMA来保护神经元细胞的损伤。miRNA/PUMA轴在在脑血管疾病中通路众多，有带更多的新研究新发现，也极有希望成为脑缺血性损伤的治疗开辟新途径。

6. 结语与展望

综上所述，miRNA靶向调节PUMA通路在许多非肿瘤性疾病的发生发展中起着重要作用。在不同的信号通路、不同的微环境中，miRNA对PUMA的调节也有所差异，可以表现为抑制，亦可表现为促进，具体机制有待进一步研究。

miRNA-PUMA信号通路可作为部分非肿瘤性疾病发生及预后的预测因子之一，但是如何实现miRNA-PUMA通路的精准调节还需要高质量的研究去证实，是今后的重要研究方向，也是实现基础医学走向临床应用的关键步骤。尽管如此，我相信miRNA-PUMA信号通路具有很大的研究价值，在非肿瘤性疾病的治疗中必将是今后科研研究突破的重要方向之一，必将为相关系统疾病的治疗带来更多的希望。

基金项目

青海省消化系统疾病临床医学研究中心(2019-SF-L3)。