S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂对胃肠道肿瘤诊断的研究进展

Research Progress of S-Type Cystatins in the Diagnosis of Gastrointestinal Tumors

摘要: S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂(S-type Cystatins)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中家族2的成员，包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN、SA以及S，在胃肠道恶性肿瘤的生长、侵袭转移等病理过程中发挥重要作用，并且S-type Cystatins在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤的生长、侵袭转移程度及预后相关，有望成为新型的胃肠道肿瘤诊断分子标志物。本文就半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分类、在肿瘤发生发展中的作用以及S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂在胃肠道肿瘤诊断中的价值作一综述。

Abstract: S-type Cystatin is a member of family 2 in the Cystatins Superfamily, including SN, SA and S, which play an important role in the growth, invasion and metastasis of gastrointestinal tumors. The expression level of S-type Cystatin in tumor tissue is related to the growth, invasion, metastasis and prognosis of tumor, which is expected to become a new molecular marker for the diagnosis of gastrointestinal tumors. This article reviews the classification, structure, role of cystatins in tumor development and the value of S-type Cystatins in diagnosis of gastrointestinal tumors.

1. 引言

全球癌症统计数据报告显示：胃癌是全球发病率第六的恶性肿瘤，死亡率与肝癌共同并列第二，而这其中约50%的胃癌患者在中国 [1]。同时结直肠癌在我国的发病率也位居第四 [2]。胃癌和结直肠癌早期特异症状均不典型，导致大部分患者确诊时已达疾病中晚期，错过最佳根治手术治疗时机，患者生存质量低、预后差、死亡率高，这就使早期筛查及诊断成为疾病治疗的重点。胃肠镜联合组织病理检测是当前最直接诊断胃肠道恶性肿瘤的检查方法，但因其为侵入性检查，普通内镜操作过程中不适程度较高，有消化道穿孔、出血、感染、窒息等风险，以及一些相对禁忌症的存在，难以成为大规模普通人群或胃肠道恶性肿瘤高危人群早期筛查的手段。近年来，有研究证明半胱氨酸蛋白酶抑制剂在早期胃肠道恶性肿瘤的诊断上有重要意义，所以本文将从半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分类、在肿瘤发生发展中的作用以及S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂在胃肠道肿瘤诊断中的价值作一概述。

2. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂

2.1. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族

二十世纪六十年代Fossum与Whitaker [3] 通过层析法从鸡蛋清中首次分离提纯到一种木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶抑制剂，但未进一步探索该种蛋白酶抑制剂的生物学特性。20多年后，Anasatis等 [4] 改良提纯方法，从鸡蛋清中层析出纯度更高的此类蛋白酶抑制剂，并将其命名为“Cystatin”，现在一般称之为“胱抑素”或“半胱氨酸蛋白酶抑制剂”。此后，在包括人在内的多种生物体液、分泌物、组织等中先后分离得到了多种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，后将这一类抑制剂统称为“半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Cystatins Superfamily)”。该超家族又根据氨基酸序列的相似性及结构中含有二硫键的个数，常规分为三个家族，即家族1或Stefins家族，家族2或Cystatin家族，家族3或Kininogen家族，也可以称为I型、II型及III型半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。除此之外，现在发现了以植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂所组成的第四个家族 [5]。

家族1 [5] 主要包括人Stefin A、Stefin B，一般存在于细胞质中，但在细胞外液及浓度较高的体液中也有发现，是一种单链蛋白质，其结构缺乏二硫键和糖基，由约100个氨基酸残基组成。家族2中包括CystatinC、D、E/M、F、S、SN和SA，与家族1不同是，家族2 [5] 中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种胞外分泌蛋白质，广泛存在于各种分泌物、血液、唾液等体液 [6] 中，其成员一般由约120个氨基酸残基组成单链蛋白质，羧基末端有两个二硫键，在其序列的中心部分均含有一个保守的Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly片段，称为“cystatin基序”，除了E/M [7]、F [8] 的二硫键是糖基化蛋白，其余均是非糖基化的。家族3 [4] 即激肽原(Kininogen)，是哺乳动物血浆和分泌物中的大型多功能糖蛋白，人体内有H-Kininogen、L-Kininogen以及T-Kininogen，均是一串单链糖蛋白，分别由N端重链、激肽段和C端轻链组成，含有9个二硫键，与激肽酶结合形成缓激肽后发挥舒张血管等作用。

2.2. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂在恶性肿瘤发生、发展中的作用

恶性肿瘤的发生在细胞层面多是以细胞周期失控为基础，表现为细胞周期的启动、运行及以终止异常，使得细胞增殖过多，凋亡过少。无限增殖的肿瘤细胞需要新生肿瘤血管为其提供充足养分，此后随着原发肿瘤灶的快速生长，侵袭和转移成为必然结局。细胞凋亡信号系统异常是肿瘤发病过程中的普遍现象，调节细胞周期性凋亡的重要物质是溶酶体组织蛋白酶，而组织蛋白酶中大部分是半胱氨酸蛋白酶，由此对应的半胱氨酸蛋白酶抑制的量也会发生改变。半胱氨酸蛋白酶除了可以调节细胞周期外，在肿瘤侵袭、转移过程中也发挥了重要作用 [9] [10]，其原因在于细胞外基质的降解是侵袭及转移的关键步骤。

细胞外基质由糖蛋白、胶原、蛋白多糖及氨基葡聚糖等组成，以基底膜或间质结缔组织的形式存在，就像细胞外的“围墙”，在肿瘤细胞的侵袭及转移时起到屏障作用，肿瘤细胞为了躲避这种屏障，产生并释放半胱氨酸蛋白酶等组织蛋白酶参与水解细胞周围的间质组织，直接或间接利于自身的移动 [11]。本质上讲，肿瘤的侵袭与转移就是蛋白合成及水解平衡被打破的过程。半胱氨酸蛋白酶抑制剂是参与蛋白水解过程的半胱氨酸蛋白酶的竞争性抑制剂，可协调其生物活性，并作为假底物与半胱氨酸蛋白酶活性部位紧密结合，使靶半胱氨酸蛋白酶不能裂解肽键，从而阻止这种水解作用，限制肿瘤细胞的转移及侵袭 [5]。

3. S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂

3.1. S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂的发现

1984年Isemura等人用纤维素柱层析法从人全唾液中分离出一种小分子酸性蛋白，将其命名为“SAP-1”(Synapse associated protein-1)，并使用计算机分析得出SAP-1和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C之间存在54%的氨基酸序列同源性 [12]。除此之外，实验中还发现SAP-1对木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶有较强的抑制作用，而当SAP-1被还原和羧甲基化后，对木瓜蛋白酶的抑制活性则完全丧失。通过与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C氨基酸序列及其生物活性对比，推断出SAP-1也是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并正式将其命名为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S (Cystatin S)。随后Isemura、Saitoh等又先后从人全唾液中分离出半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (Cystatin SN) [13]、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA (Cystatin SA) [14]，通过氨基酸测序对比发现以上三种蛋白酶抑制剂的序列相似性约为90%，并将以上三种抑制剂统称为“S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂(S-type Cystatins)”，又称为“唾液型半胱氨酸蛋白酶抑制剂”。

为了进一步了解S-type Cystatins，Saitoh E等 [15] 从含有人类基因组DNA HindIII核酸内切酶位点的噬菌体λ文库中分离到了三个编码基因，并使用cDNA探针进行基因鉴定，显示其中两个基因分别编码Cystatin SN及Cystatin SA，将其命名为CST1 (Cystatin 1)和CST2 (Cystatin 2)，而剩余的一个则是假基因。此后又发现了编码Cystatin S的基因是CST4。CST1、CST2以及CST4 (Cystatin 4)属于一个基因家族，均聚集在人20p11.2的300 kb区域内。

3.2. S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在组织中的表达

3.2.1. S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在正常组织中的表达

S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂属于胞外分泌蛋白，广泛存在于人体的各种体液中，在唾液中的含量最高。通过对其编码基因表达部位的确定，可以更好的研究此类蛋白酶抑制剂在人体健康或疾病状态下的生物学作用。1991年Bobek等 [16] 通过Northern blotting分析确定了CST4在人颌下腺及腮腺浆液性腺泡中均有表达，在腮腺中的表达水平较低。随后Dickinson等 [17] 先后通过基因特异性核糖核酸酶保护实验(RPA)发现：CST1、CST2、CST4在颌下腺及腮腺中均有相当水平的表达，CST1、CST4在泪腺、胆囊及精囊的上皮中有不同水平的表达。特殊的是仅在气管腺体中发现了CST1，而同时也只在前列腺中发现了CST4。以上研究虽然已经确定了相关基因在部分人体组织中有表达，且这些基因存在着表达特异性，但S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达部位仍未被完全发现。

3.2.2. S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂在胃肠道肿瘤组织中的表达

现阶段已经有许多蛋白酶相关研究证实半胱氨酸蛋白酶抑制剂参与肿瘤的发生、炎症反应等，所以研究其编码基因在恶性肿瘤组织中的具体表达情况，对疾病的诊断、治疗以及预后判断十分重要。

Choi等 [18] 通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光等试验方法证实了相对于正常胃粘膜组织，胃癌组织中CST1的表达明显上调，又通过质粒转染试验观察到上调CST1表达可以促进胃癌细胞增殖。除此之外，通过比较不同病理分期的胃癌组织中CST1的水平，发现CST1的表达程度与胃癌TNM分期呈正相关。同年，Yoneda等 [19] 用ELISA法分别检测结直肠癌患者和健康者血清Cystatin SN的含量，实验结果提示Cystatin SN在结直肠癌患者血清中表达明显高于对照组。同时通过Western blot分析试验组的尿液样本，结果显示：除了Cystatin SN外未检测出其他结直肠癌尿液标志物，且结直肠癌患者尿液中Cystatin SN量较健康者增加。为了更进一步研究CST1表达情况与结直肠癌的关系，Kim等 [20] 通过质粒转染试验观察到随着CST1的表达上调，癌细胞增殖和侵袭性均增加，将该种细胞系模型移植至实验小鼠体内后，表现出肿瘤生长和转移速度的增加。以上的相关研究均说明了CST1的高表达与胃、结直肠肿瘤发生相关，且可以促进胃癌及结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。

关于CST2与胃癌的关系，Zhang等 [21] 基于Wang等 [22] 的胃癌基因图谱数据库的研究，重新选定并对比了375例胃癌组织标本和32例正常胃粘膜标本的肿瘤基因组图谱(TCGA)，显示CST2在胃癌组织中的表达水平明显高于正常组织，并且通过Kaplan-Meier曲线分析得出CST2高表达的胃癌患者的总体生存率、进展生存率均低于对照组。也通过质粒转染试验下调胃癌细胞中CST2表达，发现低表达CST2导致胃癌细胞模型的活性、侵袭和迁移均下降，反之肿瘤细胞的特性均增加。此外，还通过检测沉默或者过表达CST2后细胞周期蛋白D1、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白、TGF-β1和Smad4的变化，发现CST2的过表达是通过激活EMT/TGF-β1信号通路从而增强胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。以上实验均不仅说明CST2与胃癌的发生、侵袭以及转移相关，还探讨了CST2上游位点，这或许可以成为新的肿瘤治疗的切入点。

作为S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂的一员Cystatin S (CST4)，在近期的研究中也发现它与胃肠道肿瘤的发生相关。Wang [23] 和Cui [24] 的研究中已经发现胃癌组织中CST4的均显著上调，但未说明CST4与胃癌发生、发展的具体关系。2017年Zhang等 [25] 人在Oncomine数据库查询到已经公开的胃癌微阵列数据，并绘制了不同水平CST4的胃癌患者的Kaplan-Meier曲线，发现胃癌组织中CST4的表达水平与患者的总体预后(OS)和无进展生存期(PFS)呈负相关。在本次实验中应用实时聚合酶链式反应(qPCR)分析得出：实验组标本的CST4的表达确实明显高于正常胃黏膜组织，与数据库中的结果一致。为进一步探讨CST4在胃癌细胞中的作用，通过转染靶向CST4-shRNA下调胃癌细胞系中CST4表达，发现无论是常规培养还是软琼脂培养基，其集落形成能力均被显著抑制，反之上调CST4表达水平后，胃癌细胞的集落成形能力增强。在肿瘤异种移植模型中，将过表达CST4的细胞系移植入小鼠，肿瘤的生长的速度及体积大小明显快于低表达组。同样的，将不同表达程度的CST4胃癌细胞系同时完成迁徙试验(Transwell)和小鼠体内胃癌细胞肺转移模型实验，得出的结果是：CST4的表达程度与胃癌细胞的转移能力呈正相关。以上结果说明无论是体内还是体外，CST4均促进胃癌细胞的增殖、转移。同时，还发现了CST4是通过上游的ELFN2信号通路促进胃癌细胞的增殖、侵袭以及转移。

通过以上一系列的试验，可以得出CST1、2、4均在胃癌和(或)结直肠癌组织中表达增加，且其表达水平的高低与肿瘤细胞的增殖、侵袭及以转移能力呈正相关。在已经发表的相关研究中，S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂仅在唾液、颌下腺、腮腺、胆囊等组织中被发现，遂其作为肿瘤标志物的特异性尚可，若想其成为临床肿瘤诊断标志物，除了特异性，还需具有易于检测且准确的方法。因此，Dou等 [26] 利用CST4在胃癌组织中过表达这一特性，制备了抗CST4的单克隆抗体，建立了检测人血清CST4的酶联免疫吸附(ELISA)分析系统，该系统具有较高的特异性和敏感性。2021年吴明兰等 [27] 收集了胃癌及结直肠癌患者术前血清标本，同时收集了良性胃肠道病变患者、健康者以及干扰血清样本，通过ELISA分析测定各组血清CST4水平，得出胃癌和结直肠癌患者血清CST4浓度中位数均明显高于胃良性疾病组，Ⅳ期的胃癌和结直肠癌患者的CST4浓度中位数显著高于I至III期患者。胃癌患者CST4的受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)高于CEA、CA199、CA125；而结直肠癌患者CST4的AUC为0.67，在联合检测的四种分子标志物种排名第二，由此得出CST4对胃肠癌尤其是胃癌的诊断具有较高的参考价值，可推荐作为胃肠癌筛查的肿瘤标志物。

4. 总结与展望

现在胃肠道肿瘤的治疗方法日新月异，但其预后与疾病的诊断时期关系密切，本篇文章中所提及的S型半胱氨酸蛋白酶抑制剂在胃癌及结肠癌中均较正常组织明显表达上调，且与肿瘤的分期及预后相关，因其分子量小且出现在血液或者尿液中，使其可能成为大规模胃肠道肿瘤筛查和术后患者预后判断的预测分子标志物。在诊断上，现在已经建立了ELISA法用以检测血清CST4，虽然已有数据表明在胃癌及结直肠癌的检测中敏感性较高，但仍无法作为疾病的单一诊断指标，仍需联合其他传统肿瘤标志物做出更加准确的判断。除此之外，或许因小肠肿瘤发病率相对较低且检查方法特殊，小肠肿瘤与半胱氨酸是蛋白酶抑制剂相关研究的数据较少，此处可作为新的研究方向。