1. 引言
阿尔茨海默症(Alzheimer’s diease, AD)，又称老年痴呆，是慢性的中枢神经系统退行性疾病 [1] [2]，多发于老年和老年前期，主要临床表现为脑萎缩、认知能力减退、记忆力下降、生活不能自理，最后死亡 [3]。随着老龄化社会的发展，阿尔兹海默症已经成为除心血管疾病、肿瘤之外的最严重疾病和死亡原因，对患者的正常生活及家庭造成严重影响，已经成为神经医学亟需解决的难题。
临床上对阿尔兹海默症的治疗仍未发现特效药 [4] [5]。乌灵胶囊属于国家一类新药，是一种纯中药制剂，在临床上广泛用于焦虑、抑郁、神经衰弱、帕金森病等的治疗 [6] [7] [8]。除此之外，乌灵胶囊也能明显改善各种记忆障碍，如记忆获得、记忆巩固、记忆再现缺失等，具有益智健脑功能 [9] [10]。然而目前为止乌灵菌粉治疗阿尔兹海默症的作用机制尚不明确。
网络药理学融合了生物信息学和药理学的方法，通过数据整合与计算分析，可系统性地阐明中药及化合物与诸多疾病的相互关系，探究药物作用机制 [11] [12] [13]。因此，本研究拟采用网络药理学预测、细胞实验验证乌灵菌粉治疗阿尔兹海默症的作用靶点及可能机制，为乌灵胶囊的应用提供一定理论支持。
2. 实验数据库及软件
中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP，化学绘图工具ChemBioDraw Ultra 14.0，化合物结构数据库Pubchem，小分子药物靶点预测在线平台SwissTargetPrediction，人类在线孟德尔遗传数据库OMIM，DrugBank数据库，蛋白质数据库Uniprot，RSCB PDB数据库，在线venn图绘制网站，生物信息注释数据库Metascape，计算机辅助药物设计软件Discovery Studio 2019，软件Cytoscape 3.7.1。
3. 网络药理学方法
3.1. 乌灵菌粉主要活性成分获取
采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库，以“OB > 30%和DL ≥ 0.18”筛选乌灵菌粉的主要成分。基于TCMSP数据库筛选所得数据，同时查阅相关文献进行补充，最终确定乌灵菌粉活性成分。随后，使用3D Viewer建立所有化合物的3D结构，并保存为mol2文件格式，用于目标预测。
3.2. 乌灵菌粉主要活性成分靶点获取
从数据库中确定的乌灵菌粉活性成分，首先使用TCMSP数据库，根据特征信息及理化参数，获取相应靶点；然后利用PubChem数据库获得这些活性成分的SMILES文件，将SMILES文件导入SwissTargetPrediction网站，进行靶点预测。TCNSP数据库及STP数据库获得的所有靶点取并集，即为乌灵菌粉主要活性成分的靶点。
3.3. 阿尔兹海默症AD相关靶点收集
首先，利用关键词“Alzheimer”从OMIM数据库和DrugBank数据库中筛选阿尔茨海默症已知的治疗靶点。其次，将这些已知的阿尔茨海默症治疗靶点的基因名称导入Uniport数据库，寻找“Homo sapiens”蛋白。然后从RCSB PDB数据库中下载这些蛋白的3D结构。利用这四个数据库获得潜在的已知人源阿尔茨海默症靶蛋白。
3.4. 药物与疾病共同靶点筛选及互做网络构建
使用Venn图在线网站对AD靶点和活性成分靶点取交集，获取药物与疾病的共同靶点，绘制Venn图，交集基因即代表乌灵菌粉治疗炎症的潜在作用靶点。对筛选的活性化合物和AD预测靶点和进行统一的标准化命名(基因名)。将筛选的AD靶蛋白导入Cytoscape 3.7.1软件，获得化合物–靶点图网络。
3.5. GO和KEGG富集分析
将筛选得到的靶蛋白输入Metascape数据库进行GO基因生物过程富集和KEGG信号通路富集。
3.6. 分子对接
我们将乌灵菌粉的主要活性成分分别与高频靶蛋白进行模拟对接。首先把从RCSB PDB数据库中下载这些蛋白的3D结构导入Discovery Studio软件，去除原始配体，去除水、添加氢，优化和填充氨基酸。然后把保存为.mol2格式的活性成分结构导入软件，能量最小化。最后，选取CDocker板块进行模拟对接，计算结合能。
4. 结果
4.1. 乌灵菌粉主要活性成分
筛选获得10种乌灵菌粉主要活性成分，如表1所示。
Table 1. Main active ingredient of Wuling
表1. 乌灵菌粉主要活性成分
4.2. 乌灵菌粉主要活性成分靶点获取
利用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库对乌灵菌粉10种主要成分进行靶点预测，获得潜在靶点图1所示。
Figure 1. Targets corresponding to the main components of Wuling
图1. 乌灵菌粉主要成分对应的靶点
4.3. AD潜在靶点获取
筛选并得到66个潜在的已知人源阿尔茨海默症靶蛋白，如图2所示。
4.4. 共同靶点获取及PPI网络构建
通过匹配66个药物靶点和399个活性化合物对应的靶点，筛选出32个共同靶点。这32个共同靶点是乌灵菌粉抗阿尔茨海默症的潜在靶点。将32个靶点导入STRING数据库，得到PPI网络，如图3所示。通过观察化合物与靶蛋白之间的相互作用关系我们发现，化合物(A1、A3、A4、A5、A7、A8、A9和A10)对高频靶蛋白ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1均具有明显的作用。
Figure 3. Interaction diagram of flexibility components-potential AD targets
图3. 乌灵活性成分–潜在AD作用靶点相互作用图
4.5. KEGG富集分析结果
KEGG信号通路富集如图4所示，分析结果表明，乌灵菌粉治疗AD的靶点主要富集在12条信号通路上。主要涉及甾类激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)、阿尔兹海默症(Alzheimer disease)、钙离子(Calcium signaling pathway)等信号通路。甾类激素生物合成信号通路富集靶点最多，说明该信号通路与乌灵菌粉抗AD作用较为密切，因此后续实验选择甾类激素生物合成信号通路进行验证探讨。
Figure 4. KEGG analysis of potential AD targets of flexibility components in Wuling
图4. 乌灵活性成分潜在AD作用靶点的KEGG分析
4.6. GO富集分析结果
GO基因生物过程富集如图5所示，具有生物学过程20条，细胞成分9条，分子功能9条。BP主要涉及细胞对氮化合物的反应、对氧气水平的反应、cAMP的分解过程等；CC主要涉及细胞质的核周区域、膜筏、树突等；MF主要涉及3'，5'环腺苷酸磷酸二酯酶活性、类固醇脱氢酶活性、氧化还原酶活性等。
Figure 5. GO gene biological process enrichment
图5. GO基因生物过程富集
4.7. 分子对接结果
使用Discovery Studio 2019软件对乌灵菌粉十种主要活性成分及高频靶蛋白ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1分别进行对接，获得结合能，如表2所示。
Table 2. Docking scores of 10 compounds and 4 AD proteins
表2. 10种化合物和4种AD蛋白的对接打分
从表2可以看出，化合物A9和A10具有较好的广谱抗AD活性，我们以A10为例，进一步分析了其对接作用力，如图6所示。
Figure 6. Simulation diagram of compound A10 docking with four AD-related proteins
图6. 化合物A10与四种AD相关蛋白的对接模拟图
从图6我们可以看出，化合物A10与这四种关键AD蛋白具有很好的相互作用模式。化合物A10喹啉骨架上的氧原子可以与活性位点氨基酸Gln259，Tyr498，Leu22，Thr203，Thr231，Thr329形成氢键相互作用力；喹啉骨架上的氢原子可以与活性位点氨基酸His361，Glu377，Leu463，Leu464，Asp228形成氢键相互作用力；苯环结构上的羟基与活性位点氨基酸Ser333，Ala334，Gln165，Cys200，Gly202形成氢键作用力。此外，化合物A10与活性位点氨基酸还具有Pi-Pi或Pi-Cation相互作用力。这些作用力进一步的表明化合物A10具有较好的抗AD活性，即乌灵菌粉具有很好的抗AD活性。
5. 结论
本文基于网络药理学的方法对乌灵菌粉所含有的化合物进行了抗AD活性筛选，靶点分析和相关靶点通路预测，筛选得到10个活性物质和32个潜在的抗AD靶点蛋白以及相关靶蛋白信号通路。结果表明乌灵菌粉具有抗阿尔兹海默症的功效，可能是通过ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1靶蛋白调控甾类激素生物合成信号通路。