1. 引言
当今，包括冠心病、心肌梗死以及脑梗死在内的心脑血管疾病仍是全球人类死亡的主要原因之一，并且发病率仍呈逐年上升趋势，严重威胁人类的生命和健康 [1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是该类心脑血管疾病的主要病理基础 [2]。现代医学从不同的角度对AS的发病机制进行了阐述，如脂质渗入学说、损伤–应答反应学说、慢性炎症学说等 [3]，而近年来随着高通量测序技术的不断发展，肠道菌群对人类健康的影响得到了广泛的关注 [4]。
肠道菌群是人体最庞大并且最复杂的微生态系统，其组成改变以及其代谢产物可以通过多个方面影响宿主本身或者宿主疾病的发生发展产生，比如通过调节肠道黏膜屏障、营养物质吸收和代谢、免疫组织成熟等 [5] [6]。已有研究发现，肠道菌群组成及功能改变可对AS的发生发展产生重要影响，其导致AS的相关分子机制正在不断被科学家验证 [7] [8]。
中医药以其多靶点、不良反应小以及整体协同等特点，在治疗动脉粥样硬化等代谢性疾病方面发挥了独特的优势 [9] [10]。目前，肠道菌群逐渐被认为是中药治疗AS等代谢性疾病的靶点，其机制可能是中药影响了肠道菌群的数量、结构和功能，也可能由于肠道菌群将中药的化学成分转化为功效更强的活性成分 [11]。中药苦参(Sophorae Flavescentis Radix, SF)是豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根，归心、肝、胃、大肠经，大量研究发现其主要代谢成分氧化苦参碱具有广泛的生物活性，如保护内皮损伤、抑制平滑肌细胞增值、抗炎、降血脂等 [12]。本课题组前期研究发现，给予高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠苦参水溶液灌胃可以明显抑制其动脉粥样硬化斑块的形成 [13]。所以本实验旨在前期研究结果的基础之上，探讨苦参对AS小鼠肠道菌群结构的影响。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
SPF级雄性C57BL/6J小鼠6只、ApoE-/-小鼠(遗传背景为C57BL/6J) 42只，6~8周龄，体质量18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物实验符合贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会标准，实验动物伦理审查编号为20210002。
2.2. 实验药物
苦参胶囊(成分：苦参，批号：20190911，云南永孜堂制药有限公司)，阿托伐他汀钙片(批号：AA2003033，北京嘉林药业股份有限公司)。苦参胶囊在临用前取出胶囊内粉末，阿托伐他汀钙片在临用前研磨为粉末，分别用生理盐水配置为混悬液，在超声波清洗器中超声30 min，使其充分溶解于生理盐水。
2.3. 主要试剂和仪器
高脂饲料(含21%脂肪和0.15%胆固醇，北京博泰宏达生物技术有限公司)；超声波清洗器(型号：KQ-400E，昆山市超声仪器有限公司)；超低温冰箱(−80℃，中国海尔电器有限公司)；Illumina高通量测序仪(型号：Miseq PE300，美国Illumina公司)。
2.4. 动物分组与给药
42只ApoE-/-小鼠以及6只C57小鼠适应性喂养一周后，随机选取6只ApoE-/-小鼠喂养普通饲料并灌胃中剂量苦参水溶液(0.64 g/kg)作为预处理组(AM)；另随机选取6只喂养普通饲料作为对照组一(AP)；C57小鼠喂养普通饲料作为对照组二(CP)；剩余30只ApoE-/-小鼠喂养高脂饲料建造动脉粥样硬化模型。本课题组前期实验研究发现，给与ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养10周可以成功建造动脉粥样硬化模型 [14]。10周后，AM组继续灌胃中剂量苦参水溶液；AP、CP组灌胃相应体积生理盐水；30只造模小鼠随机平均分为模型组(M，生理盐水)、阳性对照组(Y，阿托伐他汀钙水溶液1.3 mg/kg)以及苦参高(G，1.29 g/kg)、中(Z)、低(D，0.32 g/kg)剂量组，分别进行灌胃给药。给药体积均为10 ml/kg，每日灌胃1次，共给药10周。
2.5. 样品采集及肠道菌群16S rRNA基因高通量测序
给药结束后处死小鼠，于无菌环境下打开腹腔，收集结肠内容物，置于高压灭菌的EP管中，并立即转移至−80度冰箱中。从每组6个样本中随机取3个小鼠肠道内容物进行总DNA提取，采用16S rRNA的V3-V4区引物对DNA模板进行PCR扩增，上游引物338F序列：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物806R序列：GGACTACHVGGGTWTCTAAT，以扩增后的产物进行高通量测序。本次测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
2.6. 数据分析
得到原始数据后，用vsearch (2.15.1)合并双端序列、切除barcode与引物并进行质量控制，得到fa文件。然后进行去冗余，再经usearch10的unoise3进行非聚类去噪获得单碱基精度ASV。去噪后将文件比对fa格式文件得到OTU表，再将文件比对rdp数据库进行物种注释。得到所有数据后进行Alpha、Beta、LEfSe分析并绘图，再用PICRUSt进行功能预测分析 [14]。
3. 结果
3.1. 测序结果
本次测序共获得1.8 G的数据，经合并双端序列并放至同一文件获得961 M数据，再经过切除引物与质控获得fa文件，再将序列去冗余获得3.1 M高丰度非冗余序列，经过ASV非聚类去噪获得1316条代表性序列，其中序列长度最小为409 bp，最大436 bp，平均418 bp，基本与16S rRNA基因的V3-V4区长度相符合。经去除细菌古菌、去除叶绿体、线粒体后得到1310条序列。
3.2. Alpha多样性
由图1(a)可以看出，随着抽样的不断进行，Alpha稀释曲线逐渐趋于平缓，出现了平台期，说明此次测序深度足够，测得的序列可以代表样本的整体情况，可以进行下游分析。图1(b)显示，与模型组相比，预处理组和苦参高剂量组的ACE指数显著升高(P < 0.05)，而其余各组间无显著差异，说明相比于模型组，预处理组和高剂量组提高了物种的丰富度。多样性韦恩图(图1(c))显示CP组、M组、Y组和G组之间相同和不同的物种数目，提示各组间物种种类不完全相同。
注：(a) Alpha稀释曲线；(b) ACE指数多样性分析；(c) 多样性韦恩图
Figure 1. Alpha diversity analysis
图1. Alpha多样性分析
3.3. Beta多样性
图2(a)为基于bray-curtis距离计算得到的主坐标轴分析(principal coordinate analysis, PCoA)。由图中可以看出模型组小鼠肠道菌群可以和其他组分离开来，说明肠道菌群结构存在差异。图2(b)为限制性主坐标轴分析(constrained principal coordinate analysis, CPCoA)，图中各组内样本可以聚集在一起，而组件可以分离开来，并且图中显示该平面可以解释的差异率占总差异率的36.8%，说明各组小鼠肠道菌群结构存在显著差异(P < 0.01)。
3.4. 肠道菌群结构分析
由物种堆叠柱状图可知，在门水平，占比最高的5个门分别是拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)放线菌门(Actinobacteria)以及疣微菌门(Verrucomocrobia)。相比于预处理组和对照组，模型组拟杆菌门相对丰度升高，厚壁菌门相对丰度下降，而相对于模型组，各给药组拟杆菌们相对丰度均下降，而厚壁菌门相对丰度升高(图3(a))。
注：(a) 主坐标轴分析；(b) 限制性主坐标轴分析
Figure 2. Beta diversity analysis
图2. Beta多样性分析
注：(a) 在门水平下丰度排名前8的物种；(b) 在属水平下丰度排名前8的物种
Figure 3. Species stacking histogram
图3. 物种堆叠柱状图
在属水平，相比于对照组，模型组邓氏菌属(Duncaniella)相对丰度升高，给药后该菌属丰度降低。相比于模型组，给药后邓氏菌属(Duncaniella)丰度下降，Lacrimispora菌属相对丰度升高。
3.5. 组间LEfSe差异分析
通过LEfSe(设置LDA > 2)分析找到各组间具有显著差异的细菌类群。由图4(a)看出，CP组和M组有3种物种表现出差异，其中Lawsonibacter、肠鼠杆菌(Muribaculum)在CP组富集，邓氏菌属(Duncaniella)在M组富集；M组和Y组有12种物种表现出差异，其中在属水平，普雷沃氏菌属(Prevotella)、肠鼠杆菌(Muribaculum)在M组富集，Lancefieldella、Massiliprevotella、Criibacterium在Y组富集；G组和M组有15种物种表现出差异，在属水平下，Caecibacterium、Criibacterium、Lawsonibacter、泪滴形孢子属(Lacrimispora)、回肠杆菌属(Ileibacterium)在G组富集，邓氏菌属(Duncaniella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)在M组富集。
注：(a) CP组和M组的差异菌；(b) M组和Y组的差异菌；(c) G组和M组的差异菌
Figure 4. LDA value distribution histogram
图4. LDA值分布柱状图
3.6. 功能预测
使用PICRUSt软件对各组OTU进行基于KEGG的功能预测，然后用STAMP软件进行分析，分析结果进行Welch’t-test检验。图中显示，与CP组相比，M组氯代环己烷和氯苯降解途径(Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation)显著上升；与M组相比，G组丙酮酸代谢途径(Pyruvate metabolism)、柠檬烯和蒎烯降解途径(Limonene and pinene degradation)以及糖酵解/糖异生途径(Glycolysis/Gluconeogenesis)下降，果糖和甘露糖代谢(Fructose and mannose metabolism)通路显著上升，见图5。
注：(a) CP组和M组的差异通路；(b) M组和G组的差异通路
Figure 5. Differential metabolic pathway map based on KEGG prediction function
图5. 基于KEGG预测功能的差异代谢通路图
4. 讨论
目前，肠道菌群已经被认为是中药治疗代谢性疾病的重要靶点 [15]。本课题组前期研究结果显示苦参给药可以减小AS小鼠动脉粥样硬化斑块大小，故本次实验主要目的是通过16S rRNA高通量测序技术研究苦参对AS小鼠肠道菌群结构的影响。实验结果显示，苦参给药后ACE指数升高，提示肠道菌群数量增多；韦恩图结果显示小鼠肠道菌群种类也发生了变化；Beta多样性结果显示苦参给药后小鼠肠道菌群结构发生了变化。
本次实验中，苦参给药后厚壁菌门丰度升高，有研究显示厚壁菌门的代谢多样性较拟杆菌门高 [16]，并且厚壁菌门富含与营养转运相关的基因，更利于脂类和碳水化合物的发酵和代谢，促进能量的代谢及吸收 [17] [18]。
有研究发现，肠鼠杆菌(Muribaculum)可能与葡萄糖不耐受和血脂异常相关，二者均是AS的重要致病因素 [19]。本研究中，与模型组相比，阳性组小鼠肠道菌群中肠鼠杆菌(Muribaculum)丰度降低。普雷沃氏菌属(Prevotella)属于拟杆菌门，是一种革兰氏阴性菌，有研究发现其丰度增加可刺激抗原呈递细胞产生Th17极化细胞因子IL-23和IL-1，这可能和辅助性T细胞17 (Th17)介导的黏膜炎症增加有关，另外该菌属还会刺激上皮细胞产生促炎因子IL-6、IL-8 [20]。在模型组中，普雷沃氏菌属(Prevotella)的相对丰度较苦参高剂量组高。
丁酸是主要为肠道上皮细胞供能的物质，参与肠道内糖代谢，并可促进钠的吸收 [21] [22]，Lawsonibacter是一种从人类粪便中提取出来的产丁酸盐的菌 [23]，有研究显示参苓白术散也可升高AAD大鼠肠道产丁酸盐细菌，其中包括泪滴形孢子属(Lacrimispora) [24]。本实验中苦参给药后这两种菌属相对丰度升高。
本研究中，苦参高剂量组回肠杆菌属(Ileibacterium)丰度升高，有研究表明在肥胖和高脂的模型中，回肠杆菌属(Ileibacterium)的丰度与脂肪沉积呈负相关 [25]，但也有研究表明在高蔗糖/高脂肪饮食中该菌可增加10倍，不过该菌很可能与代谢性疾病相关 [26] [27]，其具体作用需要进一步进行研究。
糖酵解为参与动脉粥样硬化形成的最重要免疫代谢途径之一 [28]，有研究表明，降低动脉粥样硬化小鼠葡萄糖转运蛋白1的表达量，则小鼠AS斑块及骨髓中糖酵解通量降低，进而减小动脉粥样硬化斑块 [29]。还有研究抑制了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，从而减少了磷酸戊糖途径与糖酵解的交互作用，降低了血管中超氧化物水平来减轻AS损伤 [30]。苦参给药后增加了小鼠肠道菌群中糖酵解/糖异生代谢途径。大量实验研究及流行病学显示，果糖摄入过量可以提升代谢性疾病的发病率 [31]，苦参喂养后果糖代谢增加，避免大量果糖积聚体内，降低了代谢性疾病风险。
5. 研究的局限性
综上所述，苦参给药后改变了动脉粥样硬化小鼠肠道菌群结构，其改善动脉粥样硬化的作用具体可能与降低普雷沃氏菌属(Prevotella)，升高泪滴形孢子属(Lacrimispora)、Lawsonibacter，以及改变回肠杆菌属(Ileibacterium)的丰度有关；苦参给药后作用的通路可能有糖酵解/糖异生途径(Glycolysis/Gluconeogenesis)以及果糖和甘露糖代谢(Fructose and mannose metabolism)途径。但机体的肠道菌群结构及组成较复杂，仍有很多肠道菌及其生物学意义无法完全检测及阐释，这有待于进一步深入研究及探讨；并且苦参改变小鼠肠道菌群后对于机体的具体作用分子机制尚不清楚，这是接下来我们的研究重点。
利益冲突
本文无利益冲突。
基金项目
贵阳中医学院2017年学术新苗培养及创新探索专项，项目编号：黔科合平台人才[2017]5735号-15。