1. 引言
膀胱癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，是男性第四大常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率较高，全世界每年约有50万新发病例和20万死亡病例 [1] 。虽然患者在发现肿瘤后采取手术切除、放化疗以及卡介苗膀胱灌注等治疗措施，但仍有超过1/3患者死于膀胱癌 [2] 。尽管免疫治疗对抑制转移性膀胱癌具有一定的效果，但晚期膀胱癌的复发率及死亡率仍较高，所以寻找新的稳定的生物标记物较早诊断及治疗膀胱癌对于提高患者预后具有重要意义，可以为抗肿瘤实验奠定基础，为膀胱癌基因治疗提供新的靶点。
双糖链蛋白聚糖(Biglycan, BGN)属于富含亮氨酸的小蛋白多糖家族(small leucine-rich proteoglycans, SLRP)的I类成员之一，是细胞外基质的关键成分，参与胶原纤维的搭建和介导细胞信号传导。许多与免疫系统、骨骼系统、肌肉组织相关的细胞均表达BGN，其表达失调可导致多种临床疾病，如代谢紊乱、无菌炎症、肌肉骨骼生长不良和恶性肿瘤。在恶性肿瘤中，其过表达与肿瘤的侵袭性及不良预后相关，因此显示出其作为生物标记物的前景 [3] 。其作用分子机制可能与TGF-β介导的传导通路、CDK2及CDK\p27通路相关 [4] 。Yuan Zhou等人基于TCGA的大量测序数据中发现BGN在直肠癌肿瘤中高表达，且在一小样本队列中进行免疫组化染色，证实BGN在正常组织和原发肿瘤中蛋白水平的差异表达，明确了BGN是直肠癌患者预后较差的潜在生物标志物 [5] 。但其与膀胱癌预后的关系目前尚存在差异。Christian Niedworok等人对76例病人进行10年的随访研究，实验数据表明BGN的高表达与肿瘤细胞增殖减少有关，肿瘤活检中BGN mRNA表达高的患者10年生存率更高 [6] 。然而Gerald B. Schulz [7] 等人对162例患者在单因素和多因素分析中，膀胱癌细胞中BGN蛋白水平的上调可能导致患者的预后较差。目前，BGN对膀胱癌发生发展中的作用研究较少且存在争议。因此，本研究拟采用生物信息学分析，通过公共肿瘤信息数据库研究BGN在不同组织及不同亚组的表达情况，并将BGN表达与肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润进行相关性分析，探讨BGN与膀胱癌进展的作用及其与膀胱癌预后生存的关系。
肿瘤微环境(TME)指肿瘤生长的周围环境，包括肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞、细胞因子等多种组织组成的，其对肿瘤的生长、增殖具有重要影响。在微环境的作用下，膀胱癌具有复发率高、进展快、容易转移的特点 [8] [9] [10] 。随着免疫检查点抑制剂的应用及深入研究，膀胱癌的治疗发生了巨大的变化。BCG膀胱灌注症治疗是目前公认的治疗非肌层浸润性膀胱癌较为成功的治疗方式 [11] 。其通过改变肿瘤微环境中免疫细胞的功能发挥作用使膀胱癌患者的预后有所改善。目前国内外很多研究表明免疫系统在乳腺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤中发挥重要作用 [11] 。而免疫细胞是免疫治疗的基础。因此研究膀胱癌TME中免疫浸润模式及其临床意义，对于进一步探索膀胱癌的免疫治疗具有重要意义。
2. 材料及方法
2.1. 标本来源
本研究选取2021.12.01~2022.7.30在青岛大学附属医院泌尿外科行手术治疗的膀胱尿路上皮癌标本19例，选取距肿瘤2 cm的癌旁组织作为对照组。
2.2. 实验设备
实验所需的主要实验设备见表1。
Table 1. Main experimental equipment
表1. 主要实验设备
2.3. 实验试剂
实验使用的主要实验试剂见表2。
75%乙醇：用Water Nuclease-Free配制；离心管、TIP头均湿热灭菌40 min，干燥。
2.4. 试验方法
荧光定量pcr
一、总RNA抽提
1) 取匀浆管，加入1 ml的RNA提取液，置冰上预冷。
2) 取100 mg组织，加入到匀浆管中。
3) 研磨仪充分研磨直至无可见组织块。
4) 12,000 rpm离心10 min取上清。
5) 加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min。
6) 4℃下12,000 rpm离心10min。
7) 将400μl上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8) −20℃放置15 min。
9) 4℃下12,000 rpm离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。
10) 吸除液体，加入75%乙醇1.5 ml洗涤沉淀。
11) 4℃下12,000 rpm离心5 min。
12) 将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min。
13) 加入15 μl Water Nuclease-Free溶解RNA。
14) 55℃孵育5 min。
15) 使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μl待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16) 将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100~500 ng/μl。
二、反转录
1) 逆转录反应体系配制(见表3)。
Table 3. Configuration process of reverse transcription reaction system
表3. 逆转录反应体系配置
2) 轻轻混匀并离心。
3) 逆转录程序设置(见表4)。
Table 4. Reverse transcription program setup table
表4. 逆转录程序设置表
三、定量PCR
1) 取0.2 ml PCR管，配制反应体系(见表5)，每个反转录产物配制3管。
Table 5. Reaction system configuration table
表5. 反应体系配置表
2) PCR扩增(PCR扩增流程表见表6)
Table 6. PCR amplification flow chart
表6. PCR扩增流程表
2.5. BGN在BLCA和正常组织的表达情况
通过TCGA数据库收集BGN在BLCA和正常膀胱组织的mRNA表达谱总计414例BLCA样本和19例正常膀胱组织样本，比较BGN表达情况及其与临床病理参数的相关性。HPA数据库 (https://www.proteinatlas.org/)是基于蛋白组学，转录组学以及系统生物学数据构建的综合数据库，可以绘制组织、细胞、器官等图谱，不仅收录了肿瘤组织，也涵盖了正常组织的蛋白表达情况，进入HPA数据库后输入BGN，检测BGN蛋白在正常膀胱组织以及膀胱尿路上皮癌中的染色结果。
2.6. BGN的预后分析
从TCGA数据库膀胱癌项目中获取所有膀胱癌患者的生存数据，使用R语言绘制生存曲线。总生存期(Overall Survival, OS)定义：确诊日期至因任何原因引起死亡的时间。疾病特异性生存期(Disease specific Survival, DSS)定义：确诊日期至因癌症导致死亡的时间。
2.7. 免疫浸润分析
利用TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中RNA-Seq表达谱数据检测肿瘤组织中免疫细胞浸润情况，使用反卷积方法推断肿瘤浸润免疫细胞(TIIC)的丰度。采用Spearman相关性分析法研究了BGN与免疫细胞表达的相关性。
2.8. 基因功能富集分析
从TCGA数据库中获取414例膀胱癌组织与19例癌旁组织的表达数据采用基因集富集分析(GSEA)获得相关性排前2位的通路。
2.9. 诊断价值分析
利用TCGA数据库中膀胱癌与癌旁组织的BGN mRNA表达量使用R语言pROC包进行受试者工作特征曲线分析评估其在膀胱癌方面的临床价值。同时利用ggplot2包绘制ROC曲线。
2.10. 统计学处理
采用R软件3.6.3版本对数据进行处理。其中R软件包“ggplot2”用于数据可视化，R软件包“survival”和“survminer”进行Kaplan-Meier生存分析，R软件包“pROC”进行ROC曲线绘制，R软件包“GSVA”分析膀胱癌与各种免疫细胞之间的关系。计量资料采用独立t检验。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. BGN在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达
对来自TCGA数据库的BGN mRNA表达谱数据分析，在泛癌中，BGN在绝大多数肿瘤中表达量均大于对照组(图1(A))。无论在配对样本及非配对样本中，BGN在膀胱癌中表达升高(图1(B)和图1(C))。荧光定量PCR结果显示：膀胱尿路上皮癌组织中BGN表达水平显著高于癌旁组织(1.14 ± 1.61 vs 0.15 ± 0.21，P < 0.001，图1(D))。经HPA数据库对BGN蛋白表达情况进行分析，发现免疫组化染色在12例膀胱癌患者中有5例未表达；4例低表达；1例中表达；2例高表达(图2(A)~(D))。
(A) 
(B) 
(C) 
(D)*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
Figure 1. Compared with normal tissues, BGN expression is elevated in various tumor tissues, including BLCA ((A)~(D))
图1. 与正常组织相比，BGN在多种肿瘤组织包括BLCA中表达升高((A)~(D))
(A) 
(B) 
(C) 
(D)
Figure 2. Staining results of bladder cancer and normal bladder tissues in HPA database (magnification × 100, (A)~(B) staining for bladder cancer tissue; (C)~(D) is normal bladder tissue staining)
图2. HPA数据库中膀胱癌和正常膀胱组织的染色结果(放大倍数 × 100，(A)~(B)为膀胱癌组织染色；(C)~(D)为正常膀胱组织染色)
3.2. BGN表达与膀胱癌患者预后的关系
从TCGA数据库下载膀胱癌患者相关临床数据进行分析。根据临床结局情况，分别进行筛选，进行Kaplan-Meier生存分析(图3(A)，图3(B))。结果表明，BGN高表达与BLCA的疾病特异生存率、总体生存率呈显著负相关关系(P = 0.001~0.017)。
(A) 
(B)
Figure 3. OS and DSS curves of BGN in bladder cancer patients
图3. 膀胱癌患者BGN的OS、DSS曲线
3.3. BLCA患者中BGN表达与临床病理参数的相关性
从TCGA数据库收集总计414例BLCA样本和19例正常膀胱组织样本。其中，BLCA组中109位女性，305位男性；黄种人有44位，黑种人有23位，白种人有330位。利用这些数据分析BGN表达水平与临床病理特征的相关性。结果表明BGN表达与患者性别、年龄、人种、病理学TNM分期等显著相关(图4(A)~(E))。
3.4. 泛癌热图分析
我们利用TIMER2.0数据库对泛癌进行免疫浸润分析，发现各种免疫细胞对肿瘤形成或抑制具有一定的作用，其中大多数免疫细胞对膀胱癌细胞的形成起到促进作用(图5)。
(A) 
(B) 
(C)
Figure 5. Pancancerous thermogram analysis
图5. 泛癌热图分析
3.5. BGN与免疫浸润水平的关联
我们通过R语言分析了BGN表达是否会影响BLCA中的各种免疫细胞浸润水平。Pearson相关分析证实了BGN表达与巨噬细胞、NK细胞、B细胞、DC细胞、Treg细胞等多种免疫细胞呈正相关(图6(A))。其中，IL-10和FOXP3是Treg细胞最具特异性的标记物，因此我们进一步分析了二者与BGN的关系。结果表明二者与BGN表达呈正相关(图6(B)，图6(C))。
(A) 
(B) 
(C)
Figure 6. Relationship between BGN and immune cell infiltration
图6. BGN与免疫细胞浸润的关系
3.6. 膀胱癌中BGN基因功能的富集分析
为了确定膀胱癌中可能与BGN有关的通路，我们利用TCGA膀胱癌数据库中的数据进行GSEA分析。结果提示:BGN在REACTOME_GPCR_LIGAND_BINDING基因集显著富集(p.adjust = 0.014; FDR = 0.010)；在REACTOME_NEUTROPHIL_DEGRANULATION基因集显著富集(p.adjust = 0.014; FDR = 0.010)，因此说明BGN在膀胱癌中的表达可能与G蛋白偶联受体、中性粒细胞脱颗粒信号通路有一定关系(图7)。
Figure 7. GSEA enrichment map of BGN gene function in bladder cancer
图7. 膀胱癌BGN基因功能的GSEA富集图
3.7. BGN ROC曲线分析
我们通过R语言绘制出ROC曲线，结果显示：在预测Tumor和Normal结局上，BGN可以作为预测膀胱癌进展的潜在分子标记物。(AUC = 0.646, CI = 0.562~0.729) (图8)。
4. 讨论
膀胱癌是临床上常见的泌尿系统肿瘤，发病率居恶性肿瘤的第9位，死亡率居恶性肿瘤的第13位。根据TNM分期分为非肌肉浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌一般采取膀胱灌注化疗；肌层浸润性膀胱癌包括新辅助治疗、手术治疗、放化疗等 [1] 。虽然肌肉浸润性和晚期膀胱癌的治疗选择已经扩展到包括检查点抑制免疫治疗、靶向治疗和抗体–药物结合治疗，但转移性膀胱癌患者5年生存率仅为5% [12] 。所以进一步研究膀胱癌的机制，找到高效的诊断方法及治疗方法迫在眉睫。
BGN属于SLRP蛋白家族，该家族分为五类，BGN属于第I类，是细胞外基质的重要组成部分。其由2个硫酸软骨素/硫酸皮聚糖GAG残基组成，核心蛋白分子量为42 kDa，基因位于x染色体上 [13] 。BGN在许多与免疫、血管、骨骼等系统有关的细胞中均有表达。BNP表达异常会引起炎症反应，可能作为重要途经参与膀胱癌的形成。Biglycan在巨噬细胞中与先天免疫Toll样受体(TLR) 2和4结合，导致p38、ERK和NF-κB快速激活从而刺激TNF-α以及巨噬细胞炎性蛋白-2表达 [14] [15] 。既往有研究结果显示，BGN可通过TLR2/4-NF-κB和P2X7-NLRP3-caspase-1信号通路直接参与肿瘤的调控，同时可以通过下游递质间接影响肿瘤的发生发展进程 [16] 。
近年来国内外研究显示BGN在胃癌 [17] 、前列腺癌 [18] 、子宫内膜癌 [19] 、肝癌 [20] 等多种肿瘤组织中表达异常，提示BGN与肿瘤的发生发展转移有相关性。其介导多条癌前信号通路导致肿瘤增殖、侵袭及转移 [3] 。NakoMaishi和KyokoHida等人 [21] 发现高转移性肿瘤的肿瘤内皮细胞中BGN特异性上调，考虑是通过激活NF-κB和ERK信号促进表达Toll样受体的肿瘤细胞迁移。Filipe Pinto [17] 等人通过体内外试验表明BGN使胃癌细胞生存、克隆及迁移等，与疾病复发和疾病晚期患者预后不良有关。Kanakaraju Manupati [22] 等人进行糖酵解和线粒体代谢试验后发现BGN敲减后，乳腺癌代谢降低，NFκB转录因子、p65和磷酸水平降低，表明BGN可能调节NFκB通路来抑制乳腺癌转移，说明BGN可能是治疗乳腺癌转移的重要靶点。
随着生物信息学技术的发展，生信分析被广泛应用于肿瘤领域用于寻找肿瘤早期标志物及发现新的治疗靶点。在本研究中，我们利用公共数据库进行生物信息学分析从而试图确定BGN与膀胱癌进展及预后的关系以及探索免疫细胞浸润与膀胱癌进展的相关机制。
通过对公共数据库中膀胱癌及癌旁数据进行分析发现BLCA中的BGN mRNA水平明显高于正常膀胱组织且在性别、人种、病理学分期等临床参数中具有显著差异。在蛋白质层面，HPA数据库中的信息表明BGN蛋白在膀胱癌组织中具有较高的阳性率。另外生存分析显示BGN高表达时患者生存期下降，说明BGN高表达与不良预后有关。GSEA分析显示：BGN在膀胱癌中的表达可能与G蛋白偶联受体、中性粒细胞脱颗粒信号通路相关。最后通过ROC曲线进一步发现BGN可以作为诊断膀胱癌的分子标记物。
在与泛癌和免疫系统的关系中发现BGN在多个肿瘤中与免疫物质有一定关系，其中膀胱癌与多种免疫物质有较高相关性。根据TIMER数据库中的数据进一步分析显示膀胱癌与各种免疫因子有密切关系。最后对TIMER数据库进行分析发现TCGA-BLCA数据集中BGN的表达水平与NK细胞、Th1细胞、嗜中性粒细胞、B细胞、DC细胞、Treg细胞等多个细胞呈正相关，表明BGN高表达可以通过提高免疫细胞浸润水平来改变BLCA的免疫微环境，从而影响患者预后。
综上所述，BGN在膀胱癌中表达升高，可能参与膀胱癌形成及发展过程；BGN的表达水平与性别、人种、病理学分期密切相关，且表达升高时患者生存时间降低，可考虑作为判断膀胱癌预后的标志物；此外我们发现膀胱癌与免疫浸润关系密切，BGN表达与肿瘤组织中各种免疫细胞的浸润水平呈明显相关，但未进行深入研究；下一步我们将进一步研究BGN在膀胱肿瘤免疫浸润中的作用及机制，为免疫治疗的细胞基础提供新的理论。
NOTES
*通讯作者Email: wangke@qdu.edu.cn