1. 引言
失眠(insomnia)是一种常见的睡眠障碍，主要以频繁而持续的入睡困难和(或)睡眠维持困难并导致睡眠感不满意为主要表现 [1] 。我国成人患病率为10%~15% [2] ，近半数严重失眠者症状可持续10年以上，长期失眠可严重影响患者的生活、工作及身心健康，使机体的免疫力低下，同时可诱发多种躯体及精神疾病，给家庭和社会带来沉重的负担 [3] [4] 。目前，失眠的治疗主要采用药物治疗和心理疗法等方法，临床一线药物治疗主要采用苯二氮䓬受体激动剂(BzRA)或褪黑素受体激动剂、具有镇静作用的抗抑郁药物等，使用这些药物可以改善睡眠，但不能治愈疾病，且长期用药易产生药物不良反应及依赖性 [5] 。中医药在疾病的治疗上具有多成分、多靶点、多通路等特点，临床应用安全有效，在改善失眠方面具有独特的优势。
失眠属于祖国传统医学中“不寐”的范畴，古代文献常称之为“不得眠”“不得睡”“不得卧”“目不瞑”等 [6] 。早在两千多年前《素问·逆调论篇》就提出了“胃不和则卧不安”的理论 [7] ，后世医家对于其病机认识主要包含了胃为升降之枢，胃失和降影响营卫运行而致失眠。“胃不和则卧不安”中的“胃”，不是现代解剖学中的胃，而是中医学脏象之“胃”，是指整个胃肠系统及其机能集合。《灵枢·本输》云：“大肠小肠皆属于胃。” [8] 现代研究表明，中枢神经系统与胃肠系统存在直接双向沟通的机制，各种精神因素的异常与应激等刺激会引起情绪、痛觉等高级中枢神经系统的变化，而后作用于脑–肠轴，进而影响胃肠运动和分泌等功能，进一步影响其精神状态，从而产生失眠等精神异常 [9] 。半夏泻心汤出自《伤寒论》，由半夏、黄芩、干姜、人参、黄连、甘草、大枣组成。王德明指出 [10] ，半夏泻心汤除了可以用于治疗慢性胃炎、胃溃疡等消化系统疾病，还可用于治疗失眠症。半夏泻心汤治疗失眠效果肯定，但仍处于临床研究中，其具体作用机制尚未阐明。
网络药理学 [11] 作为大数据时代背景下产生新兴学科，可以从系统层次和生物网络的角度出发，通过网络可视化方法展示了药物、疾病、基因、靶点之间的生物网络关系，为中药及其复方系统研究提供了新思路，为中药新药研发、临床合理用药等提供了新的科技支撑。本研究基于网络药理学及分子对接的研究方法，通过筛选半夏泻心汤有效化合物及作用靶点，分析其治疗失眠可能的信号通路及作用机制，为后续研究其治疗失眠提供药理学基础和参考依据。
2. 材料与方法
2.1. 半夏泻心汤中药活性成分及相关靶点的获取与筛选
半夏泻心汤由半夏、黄连、黄芩、干姜、甘草、人参、大枣七味药物组成，本研究通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, https://tcmspw.com/tcmsp.php)将上述7味中药依次输入，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%和药物相似性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为条件进行筛选得到各药物的有效成分及其作用靶点，通过UniProt (https://www.uniprot.org)数据库据以“Reviewed”和“Human”作为筛选条件标准化处理获得与作用靶点相匹配的基因。
2.2. 失眠相关靶点的筛选
运用OMIM (https://www.omim.org/)、DrugBank (https://go.drugbank.com/)、TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards (https://genealacart.genecards.org/)数据库以“insomnia”作为关键词进行搜索获取相关靶点，利用Uniport数据库对收集的靶点进行标准化处理，将结果合并后删除其中的重复疾病靶点，最终得到失眠疾病的相关靶点。
2.3. 获取药物与疾病交集基因
分别将“2.1”项所得到的药物活性成分基因与“2.2”项所得到的疾病基因导入在线绘图平台Venne2.1.0绘制韦恩图，并得出二者交集基因信息。
2.4. 半夏泻心汤–失眠靶点PPI网络构建
将“2.3”项所得的潜在作用靶点导入STRING数据库(https://string-db.org)，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设为“medium confidence”(>0.4)，得到蛋白间的相互作用信息，保存互作网络图及TSV格式的PPI数据，将PPI数据文件导入Cytoscape3.9.1进行图像优化，再利用内置CytoNCA插件计算各靶点的DC、BC、CC、EC、NC和LAC数值，筛选出均大于等于中位数的节点作为核心靶点。
2.5. GO及KEGG富集分析
利用Metascape数据库(https://metascape.org/)对交集靶点分别进行KEGG信号通路富集分析和GO通路富集分析。物种选择H.Sapiens，进行Custom Analysis，设置P < 0.01，获取KEGG数据及GO数据。GO分析包含3个方面：分子功能(molecular function, MF)、细胞成分(cell component, CC)和生物过程(biological process, BP)。KEGG对基因与生物学通路的关系进行分析，揭示关键基因可能的生物过程，并得到与失眠关联及潜在机制中可能性较大的通路。通过微生信在线工具(www.bioinformatics.com.cn)将KEGG数据及GO数据进行可视化分析，绘制KEGG通路富集气泡图及GO细胞组分、分子功能、生物过程三合一图。
2.6. 构建半夏泻心汤的“成分–靶点–通路”调控网络图
将“2.1”项获得的有效成分及“2.3”项获得的交集靶点及KEGG富集分析所得到的前20条通路，运用Cytoscape3.9.1软件构建“成分–靶点–通路”网络图，并运用其中Network Analysis分析该网络，筛选出关键活性成分。
2.7. 分子对接
将“2.6”项获得的关键活性成分作为小分子配体，从TCMSP数据库下载小分子的MOL2格式文件，将“2.4”项获得的核心靶点作为受体蛋白，从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载关键靶点蛋白的PDB格式文件，使用PyMOL和AutoDock软件对蛋白结构进行去水、加氢等操作，使用AutoDock Tools 1.5.7软件处理相关后保存为pdbqt格式，然后进行分子对接，再利用PyMol软件对结合能较小的组合进行可视化。
3. 结果
3.1. 半夏泻心汤有效成分及其靶点筛选结果
通过TCMSP数据库，以OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18为标准筛选活性成分，剔除没有靶点的成分，最终得到184个活性成分，其中半夏12个，黄连11个，黄芩32个，干姜5个，甘草88个，人参17个，大枣19个，部分活性成分见表1。β-谷甾醇、黄连素、槲皮素、豆甾醇、黄芩素、山柰酚、富马碱等为多药共有的成分。同时收集活性成分相关作用靶点，利用UniProt数据库将药物靶点规范为相应的基因名称，去除重复靶点，最终得到其活性成分可能作用的靶点249个。
Table 1. Some of the active ingredients of Banxia Xiexin Decoction
表1. 半夏泻心汤部分活性成分
3.2. 失眠的潜在作用靶点
通过OMIM、DrugBank、TTD、Gencards数据库对失眠靶点进行筛选，经过汇总去重后共得到疾病相关靶点1701个。
3.3. 半夏泻心汤治疗失眠的潜在作用靶点
将3.1中获得的药物潜在靶点与3.2中获得的疾病相关靶点利用在线绘图平台Venne2.1.0绘制韦恩图得到交集靶点95个，见图1。
Figure 1. Intersectional targets of Han Xia Diarrhea Heart Soup and insomnia
图1. 半夏泻心汤和失眠的交集靶点
3.4. 半夏泻心汤治疗失眠潜在靶点PPI网络构建
Figure 2. Gene network diagram of the intersection of Banxia Xiexin Decoction and insomnia
图2. 半夏泻心汤与失眠交集基因网络图
将得到的交集靶点上传至STRING数据分析平台，得到PPI网络及相关信息，再运用Cytoscape3.9.1进行图像优化，见图2。网络图中共含有95个节点，951条边，平均Degree值为20.02。其中节点越大、颜色越深表示degree值越大，边越粗、颜色越深代表节点间关联分值越高。通过分析所有节点，得出BC、CC、EC、LAC以及degree的中位数分别为40.58570361、0.487046632、0.047061466、7.6、17，以此为条件共筛选出24个靶点，提示其可能是半夏泻心汤发挥作用的关键靶点，见图3。
3.5. GO功能富集分析及KEGG通路富集分析结果
利用Metascape平台对半夏泻心汤治疗失眠的潜在作用靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，均保留P < 0.01的结果，得到GO条目1567条，其中CC79条，主要涉及突触后膜(postsynaptic membrane)、膜伐(membrane raft)、受体复合物(receptor complex)、谷氨酸能突触(glutamatergic synapse)等；BP1340条，主要涉及细胞对有机环状化合物的反应(cellular response to organic cyclic compound)、化学突触传递(chemical synaptic transmission)、对异生刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)、血液循环(blood circulation)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)等；MF148条，主要涉及神经递质受体活性(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、儿茶酚胺结合(catecholamine binding)、血红素结合(heme binding)、胺结合(amine binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)等，对较重要的条目运用微生信在线工具绘制GO通路富集分析柱状图，见图4。
KEGG通路富集分析共富集185条信号通路，主要涉及脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、神经活性配体–受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、化学致癌–受体活化(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、癌症的通路(Pathways in cancer)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、CGMP-PKG信号通路(CGMP-PKG signaling pathway)等，对较重要的条目运用微生信在线工具绘制KEGG通路富集分析气泡，见图5。
Figure 4. GO function enrichment analysis
图4. GO功能富集分析
Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis bubbles
图5. KEGG通路富集分析气泡
3.6. 半夏泻心汤的“成分–靶点–通路”网络图构建与分析
运用Cytoscape3.9.1软件构建“成分–靶点–通路”网络图，见图6。其中正方形紫色节点为交集靶点，圆形蓝色节点为活性成分，倒三角绿色节点为通路，节点的大小代表度值，面积越大说明该节点度值越高越重要。每条边代表活性成分、靶点、通路之间的相互作用关系。由网络图分析可知，作用靶点较多的关键活性成分有槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)、斯蒂芬琳(stepharine)等，见表2。
Figure 6. Composition-target-pathway diagram of Banxia Xiexin Decoction
图6. 半夏泻心汤成分–靶点–通路图
Table 2. Table of key active ingredients
表2. 关键活性成分表
3.7. 分子对接结果
将筛选出的degree值排名前3的核心靶点ATK1、IL6、TNF与排名前5的有效效核心成分槲皮素(MOL000098)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、豆甾醇(MOL000449)、斯蒂芬琳(MOL012921)进行分子对接，将对接分值记录下来，并用Excel将对接结果绘制成热图，见图7。一般认为，结合能越小，受体与配体之间的活性越强，稳定性越高。分子对接结果显示，核心靶点与核心成分均有较强的结合能力，其中β-谷甾醇与ATK1、β-谷甾醇与IL6、豆甾醇与ATK1结合能较高，利用Pymol将部分对接可视化后见图8~10。
4. 讨论
失眠作为一种常见的睡眠障碍，其发生主要与下丘脑–垂体–肾上腺轴、多巴胺、5-羟色胺、神经肽、乙酰胆碱、γ氨基丁酸等中枢神经递质因子和褪黑素、前列腺素D2等激素调节因子以及白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等细胞因子调节下睡眠觉醒交替发生等因素有关 [12] 。现代医学把失眠的发生概括为三大因素：易感因素，诱发因素和持续因素 [13] 。中医学在《黄帝内经》中就提出了该病的总病机当属“营卫不和，阴阳不交” [14] ，认为失眠的发生主要与涉及五脏，以心最多，同时与胃、胆等脏腑相关。病理性质上以实多虚少，亦见两者兼而有之。本研究主要通过网络药理学和分子对接技术，阐述半夏泻心汤治疗失眠的潜在作用机制。
网络药理学结果显示，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等184个成分为治疗失眠的潜在活性成分，槲皮素、山奈酚均为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和保护神经等多种活性成分，对中枢神经具有抑制作用，具有一定改善睡眠的作用 [15] [16] ，已有研究表明，山奈酚对多种应激条件引起的神经元损伤具有保护作用。β-谷甾醇可以通过血脑屏障，影响GABA神经突触通路，调节神经营养因子，并进入线粒体，提高线粒体跨膜电位和ATP量，从而减少神经元的凋亡，还可以抑制NF-κBp65、p38和ERK的磷酸化，减少小胶质细胞中促炎介质的产生，保护神经元 [17] 。有动物实验表明，豆甾醇有促进神经调节作用，可能有利于改善神经退行性疾病，可激活谷胱甘肽的神经活性、上调γ-氨基丁酸(GABA)水平，下调多巴胺(DA)、丙二醛、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、乙酰胆碱酯酶(AChE)水平从而调节精神症状，改善脑功能 [18] 。
结合PPI网络分析可发现ATK1、IL6、TNF等为关键靶点。ATK1基因编码的丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶，可控制成人神经发生过程中新生神经元整合过程的速度，对神经系统的正常发育和功能至关重要。研究发现，在原发性失眠伴焦虑大鼠中ATK1的表达异常升高，而在症状改善后ATK1的表达明显下降 [19] 。有研究表明，失眠与某些炎症基因表达的调节有关，如IL6、肿瘤坏死因子。大量的实验表明，TNF参与睡眠调节，可以减少一氧化氮和自由基的产生，改变兴奋性神经介质传递，维持神经元的钙稳态和诱导神经营养因子的合成 [20] 。
KEGG通路富集分析显示，半夏泻心汤治疗失眠主要涉及神经活性配体–受体相互作用、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌–受体活化、癌症的通路、TNF信号通路等。神经活性配体–受体相互作用与睡眠的神经化学机制相关，是神经元传导过程中的重要通路，目前认为的调节睡眠觉醒的分子因素都通过该通路发挥作用 [21] 。动脉粥样硬化会影响大脑动脉供血，如果动脉粥样硬化严重导致脑白质髓鞘病变非常严重，就会出现失眠、黑白颠倒、记忆力减退等这一系列的临床表现。TNF通路是炎症反应的重要通路，免疫反应、免疫因子都会干扰睡眠，研究表明大多数感染过程会延长慢波睡眠，减少清醒和快波睡眠 [22] 。分子对接结果显示，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等活性成分与靶蛋白ATK1、IL6、TNF等具有较好的对接活性，提示半夏泻心汤的活性成分与靶蛋白稳定结合，以此发挥治疗失眠的作用。
本文以半夏泻心汤为研究对象，通过网络药理学的方法初步揭示了半夏泻心汤可以通过多个活性成分及作用靶点，调节多条通路共同作用于失眠，为半夏泻心汤的临床应用提供了参考。
基金项目
WJ2023M097湖北省卫生健康委2023~2024年度面上项目；ZY2023Q010湖北省中医药管理局2023~2024年度中医药青年人才项目。
NOTES
*通讯作者。