1. 介绍
肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因 [1] 。由于我国人口基数大、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)发病率高，仅我国肝癌病例数就占全世界病例数的一半左右，这给我国造成了沉重的医疗负担 [2] 。HCC起病隐袭，多数无临床症状，约39.0%~53.6%的HCC患者在首次就诊时被诊断为晚期，其中大多数人获得手术治疗的机会有限。根据是否侵犯肝内血管、肝外转移或两者兼而有之的不同类型，晚期HCC患者的中位生存期仅为5.7、3.9或3.0个月，一年生存率仅为12.0%、38.3% [3] [4] ，不可切除的肝癌约占确诊肝癌病例的一半。近年来，免疫治疗与靶向药物联合治疗HCC取得了令人惊讶的效果。事实上，一些晚期HCC患者通过使用靶向治疗结合免疫治疗已经实现了完全缓解。然而，仍有一些患者对靶向治疗联合免疫治疗存在原始耐药性，迫切需要确定哪些患者可能从该治疗方案中获益最多。
以程序性细胞死亡受体1 (PD-1)/程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)通路为代表的免疫抑制治疗已成为肝癌患者改善肿瘤反应、延长生存期的重要选择。卡瑞利珠单抗作为我国首个自主研发的肝细胞PD-1单克隆抗体药物，可以靶向PD-1，阻断其与PD-L1的相互作用，恢复机体的免疫功能，发挥抗肿瘤作用。随着大量临床试验的开展，卡瑞利珠单抗在肝癌的治疗中也显示出良好的临床疗效 [5] 。目前，它已被中国食品药品监督管理局批准用于治疗既往接受过索拉非尼或奥沙利铂化疗的晚期肝细胞癌 [6] 。此外，卡瑞利珠单抗在优化和调节肿瘤免疫微环境方面也呈现其重要特性。HCC的肿瘤异质性和复杂的肿瘤微环境是导致肝癌患者治愈困难和高复发率的重要原因，但目前尚无有效手段能够准确预测肿瘤复发。
近年来，中性粒细胞与淋巴细胞比率(NLR)等全身炎症反应标志物被认为是诊断患有不同癌症(如肝癌和肺癌)的患者生存的有效预测因子 [7] 。Halazun等首先描述了NLR与HCC之间的关系，结果表明NLR升高与HCC患者总生存率差和复发率高相关 [8] 。越来越多的证据表明，NLR是肝移植术后和索拉非尼治疗后的预后预测因子，但尚无研究评价NLR对卡瑞利珠单抗联合靶向药物治疗晚期HCC患者疗效的预测价值。
因此，本文探讨治疗前NLR对接受卡瑞利珠单抗联合靶向药物治疗的晚期HCC患者预后的预测价值，以期通过治疗前NLR指导HCC患者的靶免联合治疗，识别对靶免联合治疗有反应的患者，避免对无反应的患者继续治疗的不良后果。
2. 材料和方法
2.1. 患者
我们按照严格的标准选择入组患者。纳入标准：1) 具有完整的HCC基线临床数据，2) 接受过至少一次卡瑞利珠单抗治疗，3) 影像学或病理诊断为晚期肝癌，4) 既往接受过索拉非尼或奥沙利铂化疗。排除标准：1) 接受除卡瑞利珠单抗联合靶向治疗以外的其他免疫药物治疗的患者，2) 合并其他肿瘤，3) 严重器官系统并发症，如严重心血管疾病、慢性肾病、慢性阻塞性肺疾病，4) 妊娠或哺乳，5) 临床资料不完整。
2.2. 方法和数据收集
70例患者每3周静脉注射200 mg卡瑞利珠单抗，联合包括瑞戈非尼、索拉非尼或仑伐替尼在内的靶向药物治疗。剂量延迟是由于耐受性和毒性引起的，治疗持续到疾病进展。如果专业医生确认他们会受益并且能够耐受继续治疗，那么诊断出疾病进展的患者也将被允许继续使用。治疗前1周内采集每位患者3 ml静脉血进行全血细胞计数，获得炎症指标，NLR为中性粒细胞与淋巴细胞的绝对比值，将其用于绘制ROC曲线。
自治疗开始后，每3个月进行一次增强计算机断层扫描或磁共振成像，并根据实体瘤疗效评估标准(mRECIST) [9] 评估影像结果。完全缓解(Complete Response, CR)定义为所有靶病灶消失、无新病灶且肿瘤标志物指标正常至少持续4周。部分缓解(Partial Response, PR)定义为病变最大直径总和减少超过30%并维持至少4周。疾病稳定(Stable Disease, SD)定义为未降至PR标准或未扩大至疾病进展标准的目标病灶最大直径之和。疾病进展(Progressive Disease, PD)定义为病变最大直径增加超过20%或出现新病变。客观缓解率(Objective Response Rate, ORR)定义为完全缓解率和部分缓解率之和。疾病控制率(Disease Control Rate, DCR)定义为完全缓解、部分缓解和疾病稳定的发生率之和。总生存期(Overall Survival, OS)定义为从卡瑞利珠单抗联合靶向治疗开始至全因死亡或至随访结束的时间。无进展生存期(Progressive Free survival, PFS)定义为从开始卡瑞利珠单抗联合靶向治疗到第一次影像学显示疾病进展或任何原因死亡的时间。CR、PR或SD患者(未达到CR或PR但肿瘤负荷在至少4周内没有增加20%或更多的患者)被认为已实现合理的疾病控制。主要终点是OS，次要终点是PFS、DCR和ORR。
2.3. 统计学分析
采用卡方检验或Fisher精确检验分析两组患者基线特征的差异。数字(百分比)用于分类变量。使用Kaplan-Meier方法估计中位OS和PFS。采用单变量和多变量Cox比例风险模型评估基线临床病理特征对OS和PFS的预后影响，获得风险比(HR)和95% CI，单变量分析中P < 0.1的因素纳入多变量分析。两侧P < 0.05被认为具有统计学意义。对某些基线数据进行亚组分析，以评估OS、PFS和基线变量之间的相关性。P < 0.05为有统计学意义，所有统计分析均采用SPSS25.0统计软件进行。
3. 结果
3.1. 临床病理参数
回顾性分析自2020年6月至2022年3月于青岛大学附属医院接受卡瑞利珠单抗联合靶向治疗的95例HCC患者，其中70名患者参与了这项研究(图1) 25例患者的排除原因如下：影像学数据缺失(n = 19)、与其他肿瘤合并(n = 6)。根据NLR理想阈值2.11，将患者分为NLR低值组(n = 35)和NLR高值组(n = 35)，比较两组的临床特征数据。如表1所示，两组性别、年龄、BCLC分期等基线数据无显著统计学差异。
Table 1. Baseline demographic and clinical characteristics
表1. 基线人口统计学和临床特征
BCLC: Barcelona Clinic Liver Cancer; AFP: Alpha-Fetoprotein; TACE: Trans-Arterial Chemoembolization.
3.2. NLR预测晚期肝癌患者靶向免疫治疗后生存的ROC曲线
治疗后OS的ROC曲线显示，约登指数最大值时NLR的截断值为2.11，曲线下面积为0.742。此时的预测灵敏度为92.3%，特异性为59.6% (图2)。该值用于将患者分为NLR高值组(≥2.11, n = 35)和NLR低值组(<2.11, n = 35) (图2)。
Figure 2. ROC curve of neutrophil to lymphocyte ratio for predicting overall survival time of HCC patients after Camrelizumab combined with targeted therapy
图2. 中性粒细胞与淋巴细胞比值预测卡瑞利珠单抗联合靶向治疗后HCC患者总生存时间的ROC曲线
3.3. 治疗前不同NLR水平的患者接受卡瑞利珠单抗联合靶向药物后的疗效评价
本队列患者的中位随访时间为21.6个月，截至数据截止时仍有16例患者(22.9%)仍在接受治疗。NLR低值组中有2名患者(2.9%)和NLR高值组有11名患者(15.7%)因疾病进展而死亡。70例患者中4例(5.7%)获得完全缓解，14例(20.0%)获得部分缓解，13例(18.6%)病情稳定，39例(55.7%)出现疾病进展，客观缓解率为25.7%，疾病控制率为44.3%。其中，NLR低值组中CR、PR、SD、PD分别为3例、10例、8例、14例。NLR高值组中CR、PR、SD、PD分别为1例、4例、5例、25例。NLR低值组的ORR显著优于NLR高值组(37.1% vs 14.3%, P = 0.029)，NLR低值组的DCR也显著优于NLR高值组(60.0% vs 28.6%, P = 0.008) (图3)。
Figure 3. Evaluation of the efficacy of Camrelizumab combined with targeted agents in patients with different NLR levels
图3. 评价卡瑞利珠单抗联合靶向药物在不同NLR水平患者中的疗效
3.4. 预后因素分析
OS影响因素分析(表2)：根据单因素COX比例风险回归分析，NLR水平(HR = 0.190, 95% CI 0.042~0.856, P = 0.031)、是否患有乙型病毒性肝炎(HR = 1.848, 95% CI 1.021~3.345, P = 0.042)，是否转移(HR = 0.564, 95% CI 0.312~1.019, P = 0.058)与患者的OS相关。将P ≤ 0.100的单因素纳入多因素COX比例风险回归分析，通过输入分析显示NLR水平(HR = 0.195, 95% CI 0.043~0.886, P = 0.034)。乙型病毒性肝炎感染(HR = 2.145, 95% CI 1.152~3.993, P = 0.016)和肿瘤转移状态(HR = 0.516, 95% CI 0.277~0.961, P = 0.037)是影响患者OS的独立危险因素。
Table 2. Univariate and multivariate COX proportional hazards regression analyses affecting overall survival time
表2. 影响总生存时间的单因素及多因素COX比例风险回归分析
PFS影响因素分析(表3)：根据单因素COX比例风险回归分析，NLR水平(HR = 0.244, 95% CI 0.068~0.876, P = 0.030)、乙型病毒性肝炎感染(HR = 1.695, 95% CI 0.944~3.043, P = 0.077)和肿瘤转移状态(HR = 0.478, 95% CI 0.273~0.838, P = 0.010)与患者的PFS相关。将单因素P ≤ 0.100纳入多因素COX比例风险回归分析，输入法分析显示NLR水平(HR = 0.293, 95% CI 0.080~1.071, P = 0.043)和肿瘤转移状态(HR = 1.584, 95% CI 0.867~2.818, P = 0.025)是影响肝癌患者PFS的独立危险因素。
Table 3. Univariate and multivariate COX proportional hazards regression analyses affecting progression free survival
表3. 影响无进展生存时间的单因素及多因素COX比例风险回归分析
3.5. 低NLR和高NLR组患者的生存分析
采用Kaplan-Meier法评估治疗前NLR在预测OS和PFS中的价值。结果显示，NLR低值组的中位OS显著高于NLR高值组(10.5个月vs 9.6个月，P < 0.05)，两组中位PFS也有相同的趋势表现(6.5个月vs 5.0个月，P < 0.05)。
总体来说，我们的研究表明治疗前NLR较低的患者其OS和PFS显著延长。考虑OS、PFS和一些变量(肿瘤数量、AFP水平和BCLC分期)之间的相关性，我们进行了亚组分析。结果显示各基线数据与OS、PFS无统计学差异(图4)。
3.6. NLR低值组和NLR高值组患者治疗过程中发生的不良反应事件
所有患者发生的不良事件见表4。本研究中未发生药物相关死亡，也未发生5级药物相关不良事件。在70名患者中，48名患者(68.6%)经历了至少一种免疫相关不良事件，其中NLR低值组23例，NLR高值组25例。两组免疫相关不良事件发生率差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究中没有新的药物相关不良
Figure 4. OS and PFS survival curves in the subgroup of patients with single or multiple tumors (c), (d) with AP > 400 ng/ml or AFP ≤ 400 ng/ml (e), (f) with BCLC stage B or C (g), (h)
图4. 单发或多发肿瘤(c)、(d) AP > 400 ng/ml或AFP ≤ 400 ng/ml (e)、(f) BCLC分期B期或C期(g)、(h)亚组的OS和PFS生存曲线
事件发生，这与之前研究一致。最常见的不良事件是转氨酶升高(n = 26, 37.1%)、低蛋白血症(n = 21, 30%)、中性粒细胞减少(n = 17, 24.3%)、白细胞减少(n = 16, 22.9%)、免疫性血小板减少(n = 10, 14.3%)和腹泻(n = 8.11.4%)。只有少数患者出现较高水平(>3级)的免疫相关不良事件(n = 5, 7.1%)。
4. 讨论
HCC患者有多种治疗选择，其中肝移植和手术切除是主要的治疗方法。然而，大多数肝癌患者已处于治疗中晚期，错过了最佳手术时机。尽管目前正在开发许多个性化治疗方案，例如免疫检查点抑制剂、抗血管存活靶向药物、靶向药物联合免疫治疗，但由于多种原因，患者治疗后的总体生存率仍不理想。因此，迫切需要寻找能够预测HCC患者预后的指标，以提高中晚期患者的治疗效果。文献表明炎症参与HCC [10] 的发和进展。据报道，NLR作为一种炎症指标，是一个潜在的预后标志物。这一比例的升高与不同癌症的不良预后有关，如乳腺癌 [11] 、胃癌 [12] [13] 等。卡瑞利珠单抗是我国近年来自主研发的人源化程序性死亡受体1 (PD-1)药物。它能靶向高表达的CD4+和CD8+ T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞，与T细胞表达的PD-1受体结合，阻断PD-1介导的免疫抑制反应，恢复机体的抗肿瘤免疫，从而形成肿瘤免疫治疗的基础 [14] 。本研究探讨治疗前NLR对接受卡瑞利珠单抗联合靶向治疗的晚期HCC患者的预后价值。此前的研究表明，预后较好的患者与较低的NLR值之间存在相关性 [15] 。本研究中单因素和多因素COX比例风险回归分析显示NLR水平和转移是影响患者预后的独立危险因素。Chen等 [16] 在NLR对接受靶向治疗的HCC患者预后的研究中发现，当NLR值为2.4时，治疗后OS的预测可靠性较高，这与我们的研究结果大致相同。我们发现治疗前NLR较低(NLR < 2.11)的患者其OS (P < 0.05)和PFS (P < 0.05)显著更长。因此我们推测，一方面，中性粒细胞的增加会上调某些生长因子的表达，例如血管内皮生长因子和转化生长因子-β。它可以促进肿瘤细胞和基质细胞的生长，增加血管侵袭力 [17] ，促进肿瘤生长或转移。另一方面，许多研究证实淋巴细胞在消灭肿瘤细胞的过程中发挥着最重要的作用。当淋巴细胞减少时，患者的免疫系统下降，机体的抗肿瘤作用减弱，也会促进病情的进展。
在中国，一半以上的原发性肝癌患者感染或曾经感染过乙型病毒性肝炎。由于清除困难，病毒DNA的大量复制会损伤肝细胞，导致外周血中中性粒细胞和淋巴细胞比例失衡 [18] ，患者病情恶化，最终导致HBV相关肝癌患者预后不良。在大多数实体瘤中，炎症常常发生在组织恶变之前。全身免疫反应的发生和发展为肿瘤的转移和复发提供了适宜的微环境。肿瘤免疫微环境的异常会损害宿主淋巴细胞的免疫反应，使肿瘤细胞逃避免疫监视 [19] 。当肿瘤细胞变得免疫耐受或免疫逃逸时，肿瘤更有可能进展和转移。本研究中59例患者(84.3%)均患有病毒性乙型肝炎。根据单因素和多因素COX比例风险回归分析显示，乙型病毒性肝炎的存在与否也是影响患者治疗后OS的独立危险因素之一。另一个重要的安全问题是，使用卡瑞利珠单抗增强人体自身免疫功能的同时会引起免疫相关不良事件(irAE)。例如，本研究中有26名患者(37.1%)存在不同程度的转氨酶升高。尽管毒性可控，并没有意外安全问题发生，但在治疗期间密切监测肝功能至关重要。
我们发现两组患者之间任何水平的irAEs发生率均无统计学显著差异，这与Tada等人的研究形成鲜明对比 [20] 。Tada等人证明，高NLR患者更有可能发生irAEs并因irAEs而停止靶向免疫治疗。我们的研究结果可以部分解释为NLR > 2.11的患者仅接受了9.6个月的治疗，而NLR < 2.11的患者仅接受了10.5个月的治疗，表明没有足够的时间来观察累积毒性的发展。
这项研究存在一些局限性。首先，研究设计为单中心回顾性分析，样本量较小，且存在随访时间较短的问题，不可避免地会导致选择偏倚。由于其他药物或与肝病无关的其他慢性炎症原因的组合，NLR值的测定也可能会出现混乱。其次，大多数患者的治疗方法不同，包括手术切除、靶向治疗、射频治疗和TACE，治疗间隔也不同，因此需要进一步的前瞻性队列研究来证实。在免疫治疗过程中，阻断PD-1/PD-L1轴的药物可能会因HBV再激活而导致肝细胞遭到破坏。尽管所有乙型病毒性肝炎患者均接受了抗病毒药物治疗，但尚无足够的数据和手段来评估HBV病毒载量与肝功能异常之间的关系，因此HBV再激活是否会导致肝毒性仍不清楚 [19] 。第三，研究仅限于中国人口，不能完全代表世界人口。
5. 结论
晚期肝癌患者接受卡瑞利珠单抗联合靶向治疗前的NLR对预后具有预测价值，高NLR值通常提示患者生存预后较差。NLR是一种可靠、相对便宜且非侵入性的生物标志物，应纳入预后模型，以更好地选择患者并提高昂贵药物的利用率。
基金项目
青岛大学附属医院“临床医学 + X”项目(编号：0129709. QDFY + X2021059)；山东省医药卫生科技发展计划项目(编号：202104010650)；山东省自然科学基金项目(编号：ZR2023MH347)；北京医学奖基金项目(编号：YXJL-2022-0303-0059)。
NOTES
*通讯作者。