三种常用抗凝剂处理血液样本后DNA提取方法探讨

Discussion on the Extraction Method of DNA from Blood Samples Treated with Three Common Anticoagulants

摘要: 目的：探究血液样本在经过三种常见抗凝剂以不同浓度处理后，适宜的DNA提取方法。方法：使用肝素钠、柠檬酸钠、EDTA-Na₂三种抗凝剂以1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml四种浓度剂量对血液样本进行抗凝处理，分别采用直接扩增法、Chelex-100法和硅珠法三种不同的DNA提取方法提取血液样本中的DNA，随后进行荧光复合扩增及STR自动分型，使用直接计数法对STR分型结果进行评价，并进行统计学分析和结果比较。结果：采用三种提取方法均能提取3种抗凝剂处理的血样中的DNA，并得到不同效果的STR分型。直接扩增法处理抗凝剂浓度为1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml的血样时，STR分型结果无显著性差异(P > 0.05)，抗凝剂浓度为8 mg/ml时，结果有显著性差异(P < 0.05)。Chelex-100法及硅珠法处理抗凝剂浓度为1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml的样本时，结果均无显著性差异(P > 0.05)。结论：在研究的范围内，Chelex-100法和硅珠法提取的血液样本DNA质量不受三种抗凝剂的影响。血液样本经高浓度(≥8 mg/ml)抗凝剂处理后的DNA提取方法，不宜选用直接扩增法。

Abstract: Objective: To explore the appropriate method of DNA extraction from blood samples treated with different concentrations of three common anticoagulants. Methods: Heparin sodium, sodium citrate, and EDTA-Na₂ were used to anticoagulant the blood samples at four concentrations of 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, and 8 mg/ml. DNA was extracted from blood samples by three different DNA extraction methods, including direct amplification method, Chelex-100 method and silicon bead method, respectively. Then fluorescence multiplex amplification and automatic STR typing were performed. STR typing results were evaluated by direct counting method, and the results were statistically analyzed and compared. Results: The three extraction methods can be employed for isolating DNA from blood samples treated with different anticoagulants, resulting in the acquisition of distinct STR profiles. No significant differences were observed in STR typing results using the direct amplification method when the anticoagulant concentrations were 1 mg/ml, 2 mg/ml, and 4 mg/ml (P > 0.05). However, a significant difference was observed at an anticoagulant concentration of 8 mg/ml (P < 0.05). There were no notable distinctions between the Chelex-100 method and silica bead method when the anticoagulant concentrations ranged from 1 to 8 mg/ml (P > 0.05). Conclusion: Within the scope of the study, the DNA quality of blood samples extracted by Chelex-100 method and silica bead method was not affected by the three anticoagulants. Direct amplification is not suitable for DNA extraction from blood samples treated with high concentration of anticoagulant (≥8 mg/ml).

1. 引言

血液是法医物证检验中重要的生物检材。在法医学实践中，向血液检材中添加抗凝剂，抑制血液凝集，有利于离心后血液中各成分的有效分离，保证检测结果的准确性，为法医物证检验的结果提供有力支撑 [1] 。抗凝剂应用广泛，但抗凝剂对离体的血液标本是外源性物质，在血液样品中添加不同浓度的抗凝剂会对后续的检测结果产生不同程度的影响，实验室常用的抗凝剂有肝素(Heparin sodium)、EDTA盐(Sodium citrate)、枸橼酸钠等 [2] [3] 。目前，国内外医学各个领域对抗凝剂的应用研究均有报道，国内学者的研究发现抗凝剂可应用于人工肝治疗肝衰竭、口服抗凝药物可以降低心房颤动患者的血栓栓塞风险 [4] [5] ，Kino等人的研究结果表明，服用抗凝药物可以作为房颤消融患者的最佳围手术期抗凝策略 [6] ，但使用不同的抗凝剂处理血样对DNA质量的影响鲜有报道，而法医物证检验中DNA的质量对案件的侦查方向、证据链完整性及后续的审判至关重要。为此，本文旨在探索实验室常用的抗凝剂(肝素钠、柠檬酸钠以及EDTA-Na₂)以不同浓度处理血液样本后，更适宜的DNA处理的方法，以确保DNA质量，提高STR分型结果的准确性，为法医学的实际应用提供参考。

2. 材料

征得四名健康志愿者知情同意后，采其静脉血5 ml/人，分别以三种不同抗凝剂(肝素钠、柠檬酸钠以及EDTA-Na₂)配置成的1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml四种浓度剂量组进行处理，并设置添加与实验组等量的生理盐水的血液样本作为空白对照。取40张空白血卡，填写好相关信息并编号，具体见表1。将制备好的样本同时均匀的涂抹在空白血卡上，自然晾干，保存备用。

Table 1. Dose groups with different concentrations of the three anticoagulants

表1. 三种抗凝剂的不同浓度剂量组分组表

注：单位为mg/ml；G表示肝素钠，M表示柠檬酸钠，E表示EDTA-Na₂；G1-G4、M1-M4、E1-E4分别表示配置1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml四种浓度剂量组；A、B、C、D分别代表按照四位志愿者血液样本所分的组。

3. 方法

3.1. DNA的提取

3.1.1. 直接扩增法提取血液DNA

打孔器在血卡上取大小为0.2 cm²的血样放于2 ml EP管中，按设置好的浓度梯度直接进行PCR扩增。

3.1.2. Chelex-100法提取血液DNA

在样本血液中加入200 ul 5% Chelex-100溶液及10 ul蛋白酶K，在振荡器上反复振荡，放入56℃水浴60分钟。取出后振荡，95℃孵育10分钟，振荡摇匀10 s；使用高速离心机12,000 r/min，离心3 min，上清DNA模板备用。

3.1.3. 硅珠法试剂盒提取血液DNA

打孔器同样在血卡上取大小为0.2 cm²的血样放于2 ml EP管中，按照硅珠法试剂盒说明书提取样本DNA (流程如图1所示)。

Figure 1. Flowchart for the extraction of sample DNA using the silicon bead method kit

图1. 硅珠法试剂盒提取样本DNA流程图

3.2. PCR扩增

用PowerPlex^® 21试剂盒对D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、Penta D、TH01、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、TPOX、D8S1179、D12S391、D19S433、FGA和Amelogenin共二十一个基因座进行PCR复合扩增，同时设立灭菌纯水为阴性对照样本，2800M为阳性对照样本。

反应体系10 ul：ddH₂O 5 ul，Mix1 2 ul，Mix2 2 ul，DNA模板1 ul；

反应条件：96℃ 1 min，94℃ 10 s，59℃ 1 min，72℃ 30 s，共进行28个循环，总耗时1.5小时。

3.3. 毛细管电泳分型检测

分别取扩增产物1 ul、Marker 1ul、HIDI 9 ul，运用自动混匀机、高速离心机8000 r/min离心后采用AB 3130XL全自动荧光分析仪进行电泳。运用Gene Mapper ID-X对电泳数据进行STR数据分析。

3.4. STR分型结果评价及统计学分析

对STR分型图谱通过直接打分计数法进行评价：每个基因座分型正确，没有脱落与错误分型计1分；分型不完整或脱落计0分。每份样本检测21个STR基因座，最高分为21分，最低分为0分。采用Kruskal-Wallis检验和Games-Howell法对直接打分计数法所得数据进行统计学分析。

4. 结果

4.1. STR分型结果图谱

为了保证实验结果的准确性，分别使用2800M和灭菌纯水进行阳性对照实验和阴性对照实验，结果显示正确，如图2所示。使用三种提取方法提取三种抗凝剂保存的血液样本DNA，在一定抗凝剂浓度范围内能得到完整的STR分型结果，如图3所示。但是随着抗凝剂浓度的增加(8 mg/ml)，直接扩增法提取的血液DNA的出现STR分型不全，如图4所示。

(a)(b)注：(a) 为加入2800 M的阳性对照样本；(b)为加入灭菌纯水的阴性对照样本。

Figure 2. The STR genotyping maps of the quality control samples

图2. 质量控制样本的STR分型图谱

(a) (b)注：(a) 为完整STR分型图谱；(b) 为空白对照(未加抗凝剂)。

Figure 3. The complete STR genotyping maps

图3. 完整STR分型图谱

(a) (b)注：(a) 为采用直接扩增法提取浓度为8 mg/ml的EDTA-Na₂处理的血样所得的非完整分型图谱；(b) 为空白对照(未加抗凝剂)。

Figure 4. The incomplete STR genotyping maps

图4. 非完整STR分型图谱

4.2. 直接扩增法

直接扩增法提取三种抗凝剂处理后的血液样本DNA，在抗凝剂浓度为1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml均能得到完整的STR分型结果，而在抗凝剂浓度为8 mg/ml，直接扩增法提取的血液DNA的检出率会降低，部分个体出现STR分型不全，甚至出现等位基因脱漏。评分如表2所示。实验组与对照组统计学结果对比：抗凝剂浓度为1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml时，STR分型结果无显著性差异(P > 0.05)；当抗凝剂浓度为8 mg/ml时，结果有显著性差异(P < 0.05)。

Table 2. Scores of STR typing results of DNA extracted by direct amplification

表2. 直接扩增法提取DNA的STR分型结果评分表

注：单位为分；G表示肝素钠，M表示柠檬酸钠，E表示EDTA-Na₂；G1-G4、M1-M4、E1-E4分别表示配置1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml四种浓度剂量组；“^*”表示该组中出现STR分型不全或等位基因脱漏；A、B、C、D分别代表按照四位志愿者血液样本所分的组。

4.3. Chelex-100法及硅珠法

采用Chelex-100法及硅珠法试剂盒提取三种抗凝剂处理后的血液样本DNA，在抗凝剂浓度1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml以及8 mg/ml均能得到完整的STR分型结果，即得到的STR分型结果与对照组一致，并且无明显差异。评分如表3所示。实验组与对照组统计学结果对比：抗凝剂浓度为1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml时，结果均无显著性差异(P > 0.05)。

Table 3. Scores of STR typing results of DNA extracted by Chelex-100 method and silica beads method

表3. Chelex-100法及硅珠法提取DNA的STR分型结果评分表

注：单位为分；1~4分别表示配置1 mg/ml，2 mg/ml，4 mg/ml，8 mg/ml四种浓度剂量组；G表示肝素钠，M表示柠檬酸钠，E表示EDTA-Na₂；A、B、C、D分别代表按四位志愿者血样分的组。

5. 讨论

5.1. 抗凝剂

临床上有一些关于抗凝剂种类影响血常规等生化指标检测结果的报道 [7] [8] [9] ，但是本实验使用三种常用抗凝剂(肝素钠、EDTA-NA₂以及柠檬酸钠)进行抗凝处理，对组间数据进行分析，未发现抗凝剂种类影响DNA分型结果的现象(P > 0.05)。肝素钠是一种广泛应用于临床以及法医学实践中的抗凝剂，在体内、外均有抗凝作用，其作用机制是通过与抗凝血酶III (AT-III)结合，阻止凝血酶形成，从而发挥抗凝作用 [10] [11] 。EDTA-NA₂、柠檬酸钠两者作为实验室常用的抗凝剂，其发挥抗凝作用的作用机制是通过与血液中的钙离子形成配位化合物，阻止血液凝固 [12] [13] 。在本实验中，直接扩增法对添加三种抗凝剂的血液样本进行处理后得到的STR分型结果显示抗凝剂浓度仅在8 mg/ml时，检出率降低，而使用Chelex-100法、硅珠法处理得到的STR分型结果均完整，提示DNA分型结果的完整性可能与样本处理方法以及抗凝剂浓度有关。

5.2. 直接扩增法

直接扩增法是一种无需对样本进行任何处理的方法，在对肝素钠、EDTA-NA₂、柠檬酸钠抗凝的血液样本进行直接扩增时，未在处理过程中添加任何除抗凝剂以外会影响毛细管电泳分型结果的物质，但是采用直接扩增法对添加抗凝剂浓度为8 mg/ml的血样进行提取，DNA的检出率会降低，造成DNA的检出率会降低原因可能是：肝素钠中的大量负电荷粘多糖硫酸酯物质与细胞膜表面带正电荷的蛋白质结合，改变了细胞膜的通透性，并与DNA聚合酶结合，抑制了酶的活性，杨平岭等人报道过高剂量肝素钠会影响聚合酶链式反应，影响STR分型结果 [14] ，沈克锋等人综合分析了肝素抑制PCR反应的可能与其会抑制聚合酶链反应中DNA聚合酶(Taq酶)的活性以及其可以与PCR反应体系中镁离子结合有关 [15] ；有学者曾指出EDTA对所提取的样品DNA片段有降解作用 [16] ；上述原因都能影响STR分型结果，出现等位基因位点丢失，甚至无法检出STR分型的情况。

5.3. Chelex-100法、硅珠法

Chelex-100法和硅珠法提取三种抗凝剂处理后的血液样本DNA，两者均得到完整的STR分型结果。两种提取方法不同，使用Chelex-100法和硅珠法提取的DNA作为模板进行PCR扩增，在本实验设置的四种不同抗凝剂浓度组中均得到完整STR分型结果，可见Chelex-100法和硅珠法提取DNA的纯度较高，对STR分型结果影响较小。对于血样中添加的抗凝剂及其添加浓度的不同可能造成的影响，两种提取方法均有一定耐受性。

使用Chelex-100法提取DNA具有污染小、易操作的特点 [17] [18] [19] 。使用Chelex-100法对加入抗凝剂的待测样本进行实验时，因为Chelex-100为一种螯合树脂，能鳌合以二价金属离子为代表的多价金属离子，因此能够去除血液样本中的金属离子污染物，同时也能螯合肝素钠、EDTA-NA₂、柠檬酸钠抗凝剂中能抑制PCR反应的金属离子，抑制核酸酶对DNA的酶解作用，提升DNA模板纯度，因此经过Chelex-100法处理的血液样本STR分型不会受到抗凝剂影响，从而成功得到完整的STR分型结果 [17] [20] 。

使用硅珠法提取DNA具有简单高效、纯度高的特点 [20] ，在采用硅珠法对加入肝素钠、EDTA-NA₂、柠檬酸钠抗凝剂的待测样本进行实验时，在低pH、高盐条件下，硅珠颗粒利用其自身的硅羟基与血液中的DNA相互结合，并在高pH、低盐条件下释放DNA [21] ，从而达到分离及提取DNA的目的。因此，经过硅珠法处理的血液样本PCR扩增不会受到肝素钠、EDTA-NA₂、柠檬酸钠抗凝剂影响，成功得到完整的STR分型结果。

6. 结论

在一定的研究范围内，Chelex-100法和硅珠法提取的血液样本DNA质量不受三种抗凝剂的影响。在法医学实践中，对于使用浓度 ≥ 8 mg/ml的抗凝剂处理后的血液样本，其血样的DNA提取方法不建议采用直接扩增法，可以选择其它DNA提取方法。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。