摘要: 目的：探讨肝卵圆细胞HOCs分化为胆管上皮细胞的分化过程和分子机制，肝卵圆细胞(Hepatic oval cells, HOCs)是肝脏中具有双向分化潜能的干细胞样细胞，能够在肝脏严重损伤时分化为肝细胞和胆管上皮细胞以恢复肝脏。为系统性地明确HOCs在肝脏再生中的分化作用机制，本研究由小鼠肝卵圆细胞培养诱导分化为胆管上皮细胞的高通量单细胞转录组测序揭示HOCs分化为胆管上皮细胞中特定状态的细胞亚群和调控分化的关键作用机制。方法：HOCs在体外条件下联合表皮生长因子、干细胞生长因子、白血病抑制因子的诱导方案培养细胞，定向诱导分化为胆管上皮细胞。进行单细胞测序检测，整合测序数据进行质量控制、PCA降维分析、细胞聚类分群和t-SNE。结果：呈卵圆形、折光性强的HOCs诱导分化后细胞形态变为长梭形、铺路石样生长。单细胞测序数据的PCA降维分析将HOCs分化的细胞分为17个cluster，由HOCs的特异性marker基因Twf1和胆管细胞特异性标记物Krt19在各个亚群中的表达量异同和细胞分化的clustertree重新将HOCs分为6个细胞亚群。结论：由HOCs分化为胆管上皮细胞的单细胞测序数据鉴定出5种具有异质性的细胞类型，分别为肝卵圆细胞1 (Hepatic Oval Cell 1)、前胆管细胞1 (Pre-Cholangiocytes 1)、前胆管细胞2 (Pre-Cholangiocytes 2)、前胆管细胞3 (Pre-Cholangiocytes 3)、肝卵圆细胞2 (Hepatic Oval Cell 2)，还有一群未能鉴定明确的细胞类型未知细胞(Unknown)。
Abstract:
Objective: This study aims to investigate the differentiation process and molecular mechanisms of hepatic oval cells (HOCs) into bile duct epithelial cells. HOCs, known as hepatic oval cells, are stem cell-like cells in the liver with bidirectional differentiation potential, capable of differentiating into hepatocytes and bile duct epithelial cells to restore liver function under severe liver injury conditions. To systematically elucidate the differentiation mechanisms of HOCs in liver regeneration, this study utilizes high-throughput single-cell transcriptome sequencing of cultured mouse hepatic oval cells induced to differentiate into bile duct epithelial cells. The findings reveal specific cellular subpopulations and key regulatory mechanisms involved in the differentiation of HOCs into bile duct epithelial cells. Methods: Hepatic oval cells (HOCs) were cultured under in vitro conditions with a combination of epidermal growth factor, stem cell growth factor, and leukemia inhibitory factor to induce cell differentiation into bile duct epithelial cells. Single-cell sequencing was performed to detect cellular transcription profiles. Integrated sequencing data underwent quality control, principal component analysis (PCA) for dimensionality reduction, cell clustering, and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) analysis. Results: Following induction, the morphology of HOCs changed from oval-shaped with strong birefringence to elongated spindle-shaped cells with cobblestone-like growth pattern. Principal component analysis (PCA) of single-cell sequencing data separated the differentiated cells into 17 clusters. Re-evaluation of HOCs differentiation using cluster tree analysis based on the expression levels of specific marker genes, such as Twf1 for HOCs and Krt19 for bile duct cells, resulted in the classification of HOCs into 6 distinct cellular subpopulations. Conclusion: Single-cell sequencing data identified five distinct heterogeneous cell types derived from the differentiation of HOCs into bile duct epithelial cells. These cell types were designated as Hepatic Oval Cell 1, Pre-Cholangiocytes 1, Pre-Cholangiocytes 2, Pre-Cholangiocytes 3, and Hepatic Oval Cell 2. Additionally, there was a group of cells that could not be definitively identified, labeled as “Unknown” cells.
1. 引言
肝卵圆细胞(Hepatic Oval Cells, HOCs)是肝脏中的一类特殊细胞亚群，具有双向分化潜能，也被称为是肝干细胞的子代，当肝细胞增殖受到抑制时可分化为肝细胞或胆管细胞 [1] [2] [3] 。哺乳动物的肝脏具有非凡的再生能力 [4] [5] 。肝脏具有“双层”再生系统，其中肝细胞在急性肝损伤时增殖、再生肝脏，但当肝细胞增殖受损时，肝祖细胞或卵圆细胞在慢性肝损伤期间协调再生过程 [6] [7] 。再生组织可能来源于肝细胞或肝祖细胞(Hepatic Progenitor Cells, HPCs)的自我复制，在啮齿类动物中也称为肝卵圆细胞(Hepatic Oval Cells, HOCs)，也有研究认为肝细胞亚群和胆管细胞也是重要的来源细胞 [8] 。
目前，研究HOCs在肝脏再生中的分化机制成为了研究热点，明确HOCs的分化过程为终末期肝胆疾病病人进行再生肝脏治疗提供了可能。本文基于小鼠再生肝脏中提取的肝卵圆细胞定向培养诱导分化为胆管细胞，利用单细胞测序(Single Cell Sequencing, scRNA-seq)技术，在单个细胞水平上进行全面检测，探索HOCs分化过程中细胞类型的转变化，揭示肝脏再生过程中各细胞亚群的分化和增殖动态，从而深入了解肝再生的机制。
2. 材料与方法
2.1. 材料
1) 小鼠再生肝脏中的肝卵圆细胞HOCs进行细胞培养和SCF + EGF + LIF联合诱导方案，定向诱导分化为胆管上皮细胞 [9] ，并选取在细胞传代的中间代次P4的肝卵圆细胞制备成的单细胞悬液，进行单细胞测序。
2) 使用10 × Genomics Chromium Controller (10 × Genomics)平台，将准备好的单细胞悬液单个细胞与带有有形条码和引物的凝胶珠(Gel Beads)包裹在油滴中，细胞裂解释放mRNA与引物结合产生cDNA，构建cDNA文库，使用Illumina Navaseq 6000平台完成测序检测。原始测序下机的fastq数据采用Cell Ranger7进行分析，整理数据分为记录每个细胞cell barcode标记的barcodes.csv文件；记录每个基因ID和基因名的features.csv文件；坐标格式存储基因表达量结果的matrix.mtx (格物致和生物科技(北京)有限公司)。
2.2. 方法
2.2.1. 质控、数据过滤、标准化
本次针对HOCs P4细胞样本的单细胞测序数据采用R语言(4.3.1),安装Seurat包(4.3.0.1)、clustree (0.5.0)、monocle (2.28.0)、GSVA (1.49.3)、GSEABase (1.62.0) R包对单细胞测序数据进行读取和标准化校正。
根据矩阵创建seurat对象，并过滤掉已经死亡的细胞、线粒体基因表达异常的或多个细胞相互结合的异常细胞，具体过滤条件：1) 线粒体基因 < 5%；2) 每个基因Feature至少在三个细胞中表达，每个细胞至少表达200个feature。
2.2.2. HOCs单细胞转录组PCA降维分析
绘制PC基因表达：选取前20个PC，每个主成分包含8个基因，分别绘制PCA基因热图。
2.2.3. 细胞聚类分群分析
通过R语言处理细胞数据：根据选定的主成分和clustertree进行细胞分群。绘制各个细胞群的marker基因小提琴图
2.2.4. 注释细胞类型和可视化
绘制marker基因的点阵图进行细胞群分类：将定义分析的细胞亚群根据细胞特异性marker基因对细胞群进行注释，并通过t-SNE降维可视化细胞亚群。
3. 结果
3.1. 肝卵圆细胞细胞形态变化
培养的原代HOCs，细胞增殖，细胞数量大量增加，细胞形态学上随着分化的进程逐渐演变。同时我们使用干细胞生长因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)的联合方案，定向诱导原代肝卵圆细胞发分化为胆管上皮细胞。细胞形态由原代的卵圆形，细胞核折光很强，呈现为光亮小圆点，分化形成长梭形的细胞，呈铺路石样生长，胞质进一步扩大，最后演变成多伪足，细胞核折光性逐渐降低，并同时逐渐失去了分化的能力 [9] 。
细胞形态变化结果如图1，提取出24 h后的HOC，呈卵圆形，细胞核折光性强，细胞数量稀少。培养15 d后，细胞不断增殖，聚集生长，细胞数目增加，经过诱导因子联合方案进行向胆管上皮细胞诱导分化后，HOC细胞质逐渐呈梭形，并且围绕相邻的HOCs进行细胞增殖，可见长梭形细胞进一步增多，同一个近亲细胞增殖分裂出来的新生细胞聚集在一起，类似“铺路石”样生长。
注：A为提取再生肝脏后的原代HOCs，1 d、14 d和诱导分化后的细胞形态学表现。A提取24 h后的HOCs，呈卵圆形，细胞核折光性强，细胞数量稀少。B细胞质呈梭形，相邻HOC进行细胞增殖，细胞数量增加。C诱导分化后的HOCs，长梭形细胞进一步增多，新生细胞互相聚集，呈类似“铺路石”样生长。(×100)
Figure 1. Morphology of HOCs cell differentiation
图1. HOCs细胞分化的形态
3.2. HOCs单细胞测序数据质量
本研究通过根据单细胞测序数据中的基因数、基因分子总数和线粒体基因数分别设置过滤阈值，过滤掉多个细胞相互结合细胞、空泡细胞，筛选基因表达大于200并小于7500的细胞、线粒体基因占比小于5%的细胞(图2)。
Figure 2. HOCs single-cell sequencing data: number of expressed genes per cell, total number of molecules per cell, percentage of mitochondrial genes
图2. HOCs单细胞测序数据：细胞表达基因数、基因分子总数、线粒体基因占比
3.3. PCA降维分析
基于分析得到的基因表达量矩阵，在进行质控和筛选过滤异常细胞后，需要进一步对细胞聚类分群分析。首先需主成成分分析(principal components analysis, PCA)对表达量数据进行降维处理，然后利用降维后的结果数据选择聚类分析 [10] ，使用t-SNE (t-distributed Stochastic Neighbor Embedding)对PCA降维后的数据进行处理，并实现结果的可视化。
R语言进行PCA降维分析，绘制前20个PC的基因热图。图3可见，前五个PC的数据基因表达量有明显差异，在第17个PC之后，变化不明显，故选择17个PC，进行后续分析。
Figure 3. Heatmap of the top 20 principal component genes in HOCs single-cell sequencing data
图3. HOCs单细胞测序前20主成分基因热图
3.4. 细胞聚类分群分析
将确定的17个PCA设置为dims,在通过不同的分辨率clustertree可视化细胞的分群情况，在分辨率为1时，一共分为17个cluster，t-SNE显示不同cluster的相对位置进行可视化(图4)。由17个细胞亚群各自上调的前10个最具显著性的基因热图(图5)，结合肝卵圆细胞特异性marker基因A6 (Twf1)、Tfrc、Pkm和胆管上皮细胞的特异性marker基因Krt19、Krt18在细胞亚群中基因表达量的小提琴(图6)，发现cluster0、1、2、3、6，cluster4、5、10，cluster9、13、14，Cluster7、8、11，cluster15、16各自前10基因在细胞亚群间互相表达，具有相似性；结合clustertree向上追溯到分辨率为0.1时，提示它们能够分别共同聚类为同一类细胞(图7)。最后将17个cluster聚类为cluster0、1、2、3、6，cluster7、8、11，cluster4、5、10，cluster9、13、14，cluster12，cluster15、16这6个细胞亚群。
Figure 4. Cell t-SNE clustering plot
图4. 细胞t-SNE聚类图
3.5. marker基因细胞注释
结合相关文献和Cellmarker2.0数据库(http://117.50.127.228/CellMarker/)利用R语言小提琴图可视化marker基因的表达量(图8)，基本所有细胞亚群都表达代表干细胞特性的marker基因Itgb1、Cd44、Ly6a而不表达肝细胞的代表基因Alb、Afp，高表达肝卵圆细胞特异性marker基因的Twf1、Tfrc、Pkm注释为Hepatic Oval Cell 1、Hepatic Oval Cell 2；高表达胆管上皮细胞的特异性marker基因的Krt19、Krt18，但是低表达成熟胆管上皮细胞分泌胆汁的相关基因Ass1、Asl、Cps1，注释为胆管上皮细胞的过渡态细胞Cholangiocytes 1、Cholangiocytes 2、Cholangiocytes 3，其中Cholangiocytes 3同时高表达代表增殖状态的基因Top2a、Pcna、Mki67；最后的cluster15、16部分细胞高表达干细胞特性基因，但又不具有肝卵圆细胞marker基因，暂时标注为Unknown。
在研究细胞发育类的单细胞数据集中，细胞并不会直接分成相互离散的细胞簇，而是遵循连续的轨迹，因此可以在对单细胞数据的降维可视化图中可以展示出来，经过分析，还可以推断出每个簇中的关键标记基因 [11] 。将细胞数据注释后的结果采用非线性降维t-SNE可视化(图9)，分为Hepatic Oval Cell 1、Pre-Cholangiocytes 1、Pre-Cholangiocytes 2、Pre-Cholangiocytes 3、Hepatic Oval Cell 2、Unknow 6个细胞亚
Figure 5. Heatmap of the top 10 significant genes for each cell subtype
图5. 各个细胞亚群前10个显著性基因热图
Figure 6. Violin plot of cell marker gene expression levels
图6. 细胞marker基因表达量的小提琴图
Figure 7. Clustertree plot of HOCs cell differentiation
图7. HOCs细胞分化clustertree图
Figure 8. Violin plot of marker gene expression levels after cell annotation
图8. 细胞注释后marker基因表达量的小提琴图
群。随着HOCs的逐渐分化，在图上也可以发现，Hepatic Oval Cell 1、Pre-Cholangiocytes 1、Pre-Cholangiocytes 2、Pre-Cholangiocytes 3各个亚群之间的相对位置也具有连续性，也一定程度上验证了我们HOCs在SCF、EGF、LIF方案下被定向诱导分化为胆管上皮细胞是一个连续性的过程。
4. 讨论
肝胆疾病是全世界成人因疾病死亡的主要原因之一，尽管器官移植是最有效的治疗方式，但严重受限于供体肝脏来源数量 [12] 。肝脏是唯一具有再生能力的器官，可以通过再生维持肝脏体重比，进而维持
Figure 9. t-SNE visualization of clustering analysis after cell annotation
图9. 细胞注释后聚类分析t-SNE可视化
集体稳态 [13] 。再生潜能主要是来源于肝脏中的分化的上皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞在损伤后能够进行增殖修复的能力 [14] 。对于肝脏再生的研究是应对移植器官来源不足，对终末期肝胆疾病治疗中最有潜力的治疗方式 [12] [15] 。
在过往对影响肝脏再生的各种因素进行的研究中，试图寻找肝脏中是否存在肝干细胞，期待以肝干细胞的细胞疗法治疗终末期肝胆疾病，解决肝脏供体不足的问题。然而目前对肝脏中是否存在肝干细胞还没有明确的结论，仅发现肝脏中有一群位于连接肝细胞管系统和胆道树的hering管附近，呈椭圆形、高核浆比的特殊亚群细胞HOCs，具有双向潜能，可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞 [1] [2] [16] 。本次研究对HOCs的单细胞测序，与以往对HOCs的研究仅仅停留在细胞形态学和表面标记物水平上不同 [17] [18] ，本研究进一步通过单细胞测序技术在RNA水平上对HOCs分化细胞进行分类，系统而全面地阐述HOCs的分化潜能和分化的相关作用机制。
通过对HOCs P4代次的单细胞测序结果进行整合细胞聚类分析，在对相关文献和各类细胞的经典标记物的鉴定后，我们解析了在分化过程中不同的细胞亚群及其分化状态。在对各个细胞亚群的相关marker基因可视化后进行细胞定义，几乎大部分亚群都有表达了在正常干细胞和癌症干细胞中的标记物Cd44 [19] 、Itgb1、干细胞标记物Sca-1 (Ly6a)，表明我们提取并培养的细胞基本都具有一定的干细胞特性，肝卵圆细胞1 (Hepatic Oval Cell 1)、肝卵圆细胞2 (Hepatic Oval Cell 2)群细胞表达HOCs特异性标记物基因A6 (Twf1)、Tfrc、Pkm，而在前胆管细胞1 (Pre-Cholangiocytes 1)、前胆管细胞2 (Pre-Cholangiocytes 2)、前胆管细胞3 (Pre-Cholangiocytes 3)细胞群中表达胆管上皮细胞的标记物CK19 (krt19)、CK18 (Krt18)，同时Pre-Cholangiocytes 3还高表达了代表增殖中的相关基因Pcna、Top2a、Mki67，但是在各个细胞亚群中几乎不表达代表成熟胆管细胞能够分泌胆汁的相关基因Ass1、Asl [20] ，因此不能够将表达CK19的称为胆管上皮细胞，其本质上属于胆管上皮细胞的前体细胞，是HOCs分化过程中的过渡态细胞。本研究中的这一发现也与目前大多数肝再生的单细胞研究存在差异，不能仅根据细胞表达CK19就定义为胆管上皮细胞，而需要多个marker基因进行细胞鉴定。
本研究独特的运用clustertree (R包)和marker基因相互结合的方法，先分离出了17个细胞群，并根据对各个细胞亚群中分别显著表达的marker的基因热图和细胞特异性marker 基因的小提琴图，寻找出了一部分亚群细胞之间具有明显的相似性，最后联合clustertree对各个细胞亚群进行向上溯源，最终将分化中的HOC聚类分为肝卵圆细胞1、肝卵圆细胞2、前胆管细胞1 (Pre-Cholangiocytes 1)、前胆管细胞2 (Pre-Cholangiocytes 2)、前胆管细胞3 (Pre-Cholangiocytes 3)、未知细胞群(Unknow)共6个细胞亚群。这一研究方法也为单细胞测序的人工细胞注释提供了新的思路，加深解读运用单细胞测序技术去探索细胞之间的异质性。
本次HOCs单细胞测序的结果可以为研究HOCs的分化潜能提供重要参考依据，加深对细胞分化过程中分化阶段的理解，为HOCs向胆管上皮细胞分化的机制研究提供参考性的细胞图谱，为后续的进一步研究开辟了道路。
基金项目
云南省科学技术厅青年项目；SETD2调控H3K36Me3在小鼠肝卵圆细胞定向分化为胆管上皮细胞分化中的机制研究(编号：202001AU070016)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。