1. 引言
如今，结直肠癌(CRC)在全球最常见的恶性肿瘤中位于第三，同时在与癌症相关的死亡率中位列第二 [1] 。近年来，中国的结直肠癌发病人数和死亡人数在持续上升 [2] 。2020年，中国新增的CRC患者为555,477例，占全球新增CRC患者的28.8%，CRC相关死亡患者为286,162例，占全球的30.6% [3] 。几乎一半的病例因症状确诊时已为肿瘤晚期 [4] 。因此，通过筛查，早期发现和诊断结直肠癌，及时干预控制危险因素，对于降低CRC的发病率、死亡率以及提高的患者的生存率具有重要意义 [5] 。最近的研究证实，一些生物标志物与CRC的发生发展之间存在相关联系 [6] [7] [8] [9] ，如MSI-2高表达与结直肠癌患者的不良预后相关，并可能是结直肠癌肝转移的潜在生物标志物；Wnt7a促进结直肠腺癌的发生发展；SALL4在CRC中存在过表达，SALL4低表达与术后高生存率相关。SALL4可以作为一个潜在的诊断和预后的结直肠癌标志物；血浆中升高的miR-183可能是一个很有前景的生物标志物，可以预测CRC患者的肿瘤复发风险和不良生存。这为探求新的CRC治疗靶点提供了方向，这也将有助于患者的个性化治疗。
微小染色体维持蛋白(MCMs)包含6种相关蛋白，参与DNA复制的起始以及维持染色体的功能，在基因稳定性中扮演重要角色 [10] 。MCM4作为MCMs的重要一员，具有ATP酶活性，是DNA由超卷曲状态解开的核心，也是复制叉形成和招募其他DNA复制蛋白的关键 [11] 。最近的研究发现，MCM4的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关，MCM4在肝癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌中高表达，且与患者预后不良相关 [12] [13] [14] [15] 。然而，目前MCM4与CRC的相关性研究很是缺乏，MCM4在CRC中的作用有待探讨。
在本研究中，我们系统分析了MCM4在结直肠癌组织和细胞系中的表达情况，MCM4对结直肠癌细胞增殖的效应，我们还探讨了MCM4的表达水平在CRC中的临床意义及患者的预后情况。这些研究为进一步研究MCM4作为一种新的CRC生物标志物提供了新的思路。
2. 方法和材料
2.1. 病人和样本
选取临沂市人民医院2017~2018年行结直肠癌根治术的134例患者，获得配对CRC组织样本和邻近的正常肠壁组织样本，134例患者均被术后病理结果证实为CRC。确定患者的一般临床和病理资料，该研究经临沂市人民医院医学伦理委员会批准并获得了患者的知情同意。
2.2. 细胞系和细胞培养
两株人结直肠癌细胞系(HCT 116、Caco2)以及人正常结肠上皮细胞(NCM460)均购自中国科学院细胞库(中国 上海)。HCT 116用McCoy’s 5A培养基培养，Caco2用Dulbecco’s Modified EagleMedium (DMEM)培养，NCM460用1640培养基培养。3种培养基均含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素。细胞在37℃、5% CO2条件下培养。
2.3. 细胞转染
MCM4的特异性shRNA和非编码shRNA慢病毒载体购自Vigene Biosciences (中国，山东)。靶向MCM4的不同区域，设计了4个短发夹RNA(shRNA)，并包装到一个载体上。shRNA的序列如表1所示。将慢病毒转染到HCT 116和Caco2细胞中，HCT116以2 μg/mL浓度的嘌呤霉素筛选，Caco2以5 μg/mL的嘌呤霉素筛选，以构建稳定下调MCM4表达的细胞系。下调效果用qPCR和Western Blot实验验证。
2.4. 免疫组织化学
石蜡包埋、福尔马林固定切片后，70℃干燥60 min。石蜡切片脱蜡至水后，将切片置于磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤以修复抗原，然后放入3%双氧水溶液中，室温孵育25 min，阻断内源性过氧化物酶。滴加3% BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min完成血清封闭。切片与MCM4 (兔多克隆抗体，abcam)以1:500稀释，4℃孵育过夜。于PBS缓冲液洗涤后，与二抗室温孵育50 min。用DAB显色后，苏木精反染，乙醇脱水，清除二甲苯，显微镜下观察石蜡切片。
根据染色强度(阴性 = 0分，弱 = 1分，中 = 2分，强 = 3分)和染色阳性面积占比(0~10% = 0分，11%~50% = 1分，51%~75% = 2分，76%~100% = 3分)对MCM4的反应情况进行评分。MCM4的表达评分为染色强度评分乘以染色阳性面积占比评分。0~2分定义为低表达，3~9分定义为高表达。
2.5. RNA提取和qRT-PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen)从细胞样品中提取总RNA，根据制造商的说明使用Accurate Biotechnology反转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green Premix Pro Taq Hs qPCR试剂盒(湖南，中国)进行实时荧光定量PCR。MCM4的引物为：forward，5′-AGCATGGCACTCATCCACAA-3′和reverse，5′-GCACAGCTCGATAGATGCCT-3′。GAPDH的引物为：forward，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和reverse，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。相对定量采用2-ΔΔCt方法。
2.6. Western Blot
细胞蛋白样品由RIPA裂解缓冲液(Solarbio, China)裂解获得，蛋白浓度由BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio, China)测得。蛋白样品通过SDS-PAGE电泳并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭1.5 h后，加入一抗MCM4 (1:2000稀释，abcam)、GAPDH (1:3000稀释，Affinity，China)，4℃孵育过夜。TBST洗涤后，二抗孵育1.5 h。用ECL显影剂曝光显影。
2.7. CCK-8 细胞增殖实验
将转染后的细胞接种于96孔板中，每孔2 × 103个细胞，在37˚、5% CO2条件下培养24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂(APExBIO，美国)，于37℃、5% CO2的环境中孵育2 h，然后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
2.8. 细胞克隆形成实验
将转染后的细胞接种于6孔板中，1 × 103个细胞/孔，于含有10%胎牛血清的McCoy’s 5A和DMEM中培养10~14天。当观察到克隆时，终止培养。弃上清，用PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定20 min后，适量Giemsa染色液染色，流动的清水缓慢清洗，晾干。光学显微镜下计数克隆数。
3. 统计分析
采用SPSS 26.0进行统计分析。结果数据以平均值 ± 标准差表示。采用χ2检验分析MCM4与CRC患者的一般临床病理特征的相关性。采用t检验比较两组之间的差异。采用单因素方差分析分析三组间的差异。采用单因素和多因素Cox回归分析。所有统计检验均为双边概率检验，α = 0.05，P < 0.05被认为具有统计学意义。
4. 结果
4.1. MCM4在正常结直肠壁组织与CRC组织中的表达情况
MCM4在结直肠癌组织中的阳性表达高于正常结直肠壁组织(P < 0.01) (图1)。
4.2. MCM4的表达水平与一般临床病理特征的相关性
根据134例患者的免疫组化结果，我们将CRC患者分为两组，研究MCM4表达水平与CRC患者一般临床病理特征的相关性(表2)。如表1所示，MCM4的高表达与肿瘤大小(P = 0.030)、T Grade (P = 0.034)、N Grade (P < 0.001)、TNM Staging (P < 0.001)显著相关。MCM4的表达与年龄、性别、肿瘤位置、组织学分级、M Grade均无关(all P > 0.05)。同时，我们使用Cox比例风险模型确定了MCM4对CRC的预测价值(表3)。单因素Cox生存分析显示，肿瘤大小、组织学分级、TNM Staging以及MCM4表达水平(HR = 4.691, 95%CI = 1.621~13.581, P < 0.001)与OS显著相关(表3)。多因素Cox生存分析证实，TNM Staging (HR = 4.022, 95%CI = 1.545~10.471, P = 0.004)以及MCM4表达水平(HR = 4.691, 95%CI = 1.621~13.581, P = 0.004)是CRC患者OS的独立预后指标。此外，我们还分析了MCM4的表达水平与CRC患者预后之间的关系(图2)，如图2所示，MCM4的高表达水平与CRC患者的预后不良显著相关。
(a) 
(b)
Figure 1. MCM4 expression in human colorectal cancer tissues. (a) Immunohistochemical (IHC) staining of normal and colorectal cancer tissues for MCM4 expression (200×, 400×); (b) Expression level of MCM4 in CRC. MCM4 was significantly upregulated in colorectal cancer tissues compared with normal tissues
图1. MCM4在人结直肠癌组织中的表达。(a) 免疫组织化学(IHC)染色正常和结直肠癌组织中MCM4的表达(200×, 400×)。(b) MCM4在CRC中的表达水平。与正常组织相比，MCM4在结直肠癌组织中显著上调
Table 2. Correlation between MCM4 expression level and general clinicopathological features in 134 patients with colorectal cancer
表2. 134例结直肠癌患者MCM4表达水平与一般临床病理特征的相关性
Table 3. Univariate and multivariate analyses of OS in 134 patients with colorectal cancer
表3. 对134例结直肠癌患者的OS进行单因素和多因素分析
Figure 2. Kaplan-Meier survival analysis of MCM4 expression levels in 134 patients with colorectal cancer
图2. Kaplan-Meier生存分析134例结直肠癌患者MCM4表达水平
4.3. 与正常结肠上皮细胞相比，MCM4在CRC细胞中为高表达
为了研究MCM4在CRC中的作用，我们采用了实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和Western Blot检测MCM4在人正常结肠上皮细胞(NCM460)和结直肠癌细胞(HCT 116、Caco2)中的表达水平。结果显示，结直肠癌细胞中MCM4的mRNA水平显著高于正常结肠上皮细胞(P < 0.01，图3(a))。同时，我们还发现与正常结肠上皮细胞相比，结直肠癌细胞在蛋白水平上MCM4也为高表达水平(图3(b))。
(a) 
(b)
Figure 3. MCM4 expression levels in CRC cells (Caco2, HCT116) and human normal colonic epithelial cells (NCM460) as determined by qRT-PCR (A) and Western Blot (B)
图3. 通过qRT-PCR (A)和Western Blot (B)检测MCM4在CRC细胞(Caco2、HCT116)和人正常结肠上皮细胞(NCM460)中的表达水平
4.4. MCM4促进CRC细胞的增殖
为了研究MCM4对CRC细胞增殖的影响，我们敲低了MCM4在CRC细胞中的表达水平。qRT-PCR和Western Blot的检测结果均显示shHCT116和shCaco2在mRNA和蛋白水平上MCM4表达水平显著降低(all P < 0.01，图4)。接下来，我们通过CCK-8细胞增值实验发现，与对照组相比，敲低MCM4的表达水平可显著抑制shMCM4组的细胞增殖(图5(a)，图5(b))。类似的，敲低MCM4后，与对照组相比，CRC细胞HCT 116和Caco2的细胞克隆形成数量显著减少(图6(a)，图6(b))。以上结果都表明敲低MCM4的表达水平可抑制CRC细胞的增殖。
(a) 
(b)
Figure 4. Validation of the efficiency of MCM4 knockdown in CRC cells (a), (b). The results of qRT-PCR and Western Blot showed that the expression level of MCM4 in sh-MCM4 group was significantly lower than that in control group
图4. 在CRC细胞中验证MCM4敲低的效率(a)，(b)。qRT-PCR和Western Blot结果显示，sh-MCM4组MCM4的表达水平明显低于对照组
(a) 
(b)
Figure 5. Effect of stable knockdown of MCM4 on the proliferation of HCT116 (A) Caco2 (B) cells detected by CCK-8 cell proliferation assay
图5. CCK-8细胞增殖实验检测稳定敲低MCM4对HCT116 (a) Caco2 (b)细胞增殖的影响
Figure 6. Effect of stable knockdown of MCM4 on cell proliferation in HCT116 (a) and Caco2 (b) cells detected by cell clone formation assay
图6. 细胞克隆形成实验检测稳定敲低MCM4对HCT116 (a)和Caco2 (b)细胞增殖的影响
5. 讨论
在本项研究中，我们研究了MCM4在CRC中的作用。我们发现MCM4在CRC组织以及细胞中为高表达水平，同时，我们还研究了MCM4在CRC中的增殖作用。我们还分析了MCM4的表达水平与CRC临床病理参数的关系，提示MCM4的表达水平与CRC病理分期相关。同时，我们还发现MCM4的高表达与CRC患者的预后不良相关。Cox多因素分析显示，MCM4是CRC患者的独立预后因素。总之，我们的研究表明，MCM4可能促进CRC的发生发展且与预后不良相关。
微小染色体维持蛋白(MCMs)含有DNA依赖性ATPase，可与复制起点结合并支持DNA复制 [16] 。据报道，MCMs水平的升高与恶性细胞的增殖有关 [17] [18] [19] [20] ，此外，也预示着细胞癌变与肿瘤复发 [21] 。作为MCM家族的一份子，MCM4在DNA复制过程中起核心作用，包括MCM4在内的MCMs过表达可能导致细胞过度增殖和肿瘤的产生。而MCM4在CRC的发生发展中尚不清楚。在本研究中，我们证实了MCM4在CRC组织以及细胞中为过表达，敲低MCM4可显著降低CRC细胞的增殖速率和细胞克隆形成。此外，我们还发现，MCM4的过表达往往与患者的预后不良显著相关。这与既往的研究一致，Go Kobayashi等人研究到与正常尿路上皮相比，MCM4在尿路上皮癌中高表达且与Ki-67、HER2、EGFR、p53的高表达相关，此外还与病理分期和预后不良显著相关 [22] 。Yan Xu等人通过沉默MCM4发现肝癌细胞的增殖和集落形成明显受到抑制，还可大大降低肿瘤的生长速度 [12] 。
在我们的研究中，我们还分析出MCM4的高表达与肿瘤的病理分期、肿瘤大小等一般临床病理特征显著相关。高水平的MCM4 与患者较差的OS相关，而且，Cox多因素分析显示MCM4是CRC患者的独立预后因素。以上研究结果暗示，MCM4可能是CRC潜在的预后标志物。这与Narutaka Katsuya等人的研究结果一致，MCM4在胃癌患者中与肿瘤分期显著相关。另外，高水平MCM4与GC的预后不良相关，而且在多因素分析中，MCM4是一个独立的预后因素 [23] 。
本研究存在一定的局限性。首先，该实验需要进一步从分子机制方面研究MCM4对CRC的作用。其次，实验样本量较少，可能会存在统计偏倚。最后，需要靶向药物进一步验证对MCM4的效果。
6. 结论
综上所述，我们发现MCM4在CRC中高表达，且高水平MCM4与CRC患者预后不良相关。MCM4可能是CRC有效的生物标志物和潜在的治疗靶点。
NOTES
*通讯作者。