1. 引言
各种各样的致病微生物在自然界分布非常广泛，并在一定条件下生长、繁殖，不仅会引起各种材料的分解、变质和腐败，还威胁着人类的健康。目前，除了严格规范抗菌药物的使用，避免细菌过快地产生耐药性，还迫切需要开发一些新型的抗菌药物。抗菌剂中，有机抗菌剂杀菌力强、种类多，但其缺点是毒性大、水溶性较差等。有机抗菌剂中，酰胺类化合物是抗菌剂市场中增长最快的一类。现有的酰胺类抗菌剂的分子结构特征是：含有酰胺键；酰基端连有芳环及或氢键受体；氨基端连有芳环且在芳氨基的邻位有一个辅助基团 [1] [2]。上述酰胺类抗菌剂分子结构复杂，合成路线长，难溶于水。文献报道，药物如果在尿中溶解度小，易出现结晶而阻塞肾小管或输尿管上端。当发现结晶尿时，若不及时处理，可发展为血尿、蛋白尿、尿痛等；重者可致尿闭或尿毒症 [3]。
而应用最早和最普遍的有机抗菌剂是甲醛，它是醛类抗菌剂的一种 [4]。低浓度的甲醛为抑菌剂，高浓度可作为灭菌剂，其杀菌谱广，对细菌繁殖体及细菌芽胞以及病毒等均有杀灭作用。但甲醛具有强烈的刺激性气味，特别是对眼睛和鼻粘膜造成严重影响。此外，醛类在贮存和使用过程中易氧化，导致抗菌活性降低 [5]。
为设计新药物，磺胺药是一个很有启迪意义的例子。对氨基苯磺胺(简称磺胺)早在1908年就已合成，但当时仅作为偶氮染料的中间体，而未用于医疗方面。在1932年Mietzsch和Klarcr首次合成含有磺胺结构的红色偶氮染料，命名为百浪多息(Prontosil)。百浪多息在动物体内具有抑菌作用，而在试管中不能抑菌，说明百浪多息本身无抑菌作用。后来实验证明，百浪多息在动物体内经代谢释放出磺胺，磺胺才是百浪多息抑菌作用的基本结构 [6]。随后各国科学家以磺胺为母体，合成了大量衍生物，找到了很多优良的磺胺药，使当时许多细菌性感染，如肺炎、脑膜炎都有了特效的治疗药物，是医疗史上的一个重大进展 [7]。当磺胺分子中氨基的一个氢原子替换为其他基团，可获得一系列不吸收的衍生物，如酞磺胺噻唑、琥珀磺胺噻唑等。这些磺胺药在消化道内不溶解，但在通过消化道的过程中可被分解，释放出具有游离氨基的磺胺而发挥抗菌作用，用于治疗肠道感染 [3]。
本研究受百浪多息经动物体内经代谢释放出有效抑菌成分启发，以酰胺为母体结构，引入潜在的醛基——羟甲基，设计出一类新型抗菌剂：N-羟甲基酰胺类亲水抗菌剂(图1)。作者猜测该抗菌剂在病菌细胞内被酶分解成酰胺和甲醛，既起酰胺类抗菌剂和醛类抗菌剂作用，又克服市售酰胺类抗菌剂水溶性差、醛类抗菌剂易氧化的缺点，可望成为一类环境友好的亲水低毒抗菌剂。
Figure 1. Design of N-hydroxymethyl amide-based antimicrobial agents
图1. N-羟甲基酰胺类抗菌剂设计
2. 材料与方法
2.1. 材料
试剂：甲醛、甲酰胺、三氯乙酸、NaOH为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。胰蛋白胨、酵母浸膏、麦芽膏粉为生化试剂购自广东环凯微生物科技有限公司。琼脂条购自福建泉州市泉港化工厂。新洁尔灭(苯扎溴铵)(江西草珊瑚消毒用品有限公司)。
供试菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)以上菌种均由集美大学微生物实验室提供。
仪器：NMR仪(Bruker AV400，Bruker公司)，UV-Vis分光光度计(UV5200，上海元析仪器有限公司)，恒温培养箱(MJ-160B-II型，上海跃进医疗器械厂)，恒温培养摇床(HWY-2112，厦门德维科技有限公司)。
2.2. N-羟甲基甲酰胺的合成
甲酰胺与甲醛在碱催化剂催化下反应制得N-羟甲基甲酰胺(HOF)，反应式如图2：
HOF的合成按文献 [8] 方法合成，略作修改。具体如下：
1) 在250 mL圆底烧瓶中，加入甲酰胺20 mL (0.5 mol)，碱催化剂NaOH 0.12 g和水25 mL，搅拌溶解，调节pH为9左右，用冰水冷却至5℃以下。
2) 缓慢滴加37%甲醛溶液44 mL (0.55 mol)。滴加过程中，反应放热，继续用冰水浴维持反应温度在10℃以下。滴加完毕后，缓慢升温至室温，搅拌反应24 h。反应期间控制pH持在9左右。
3) HOF的纯化：将反应所得的HOF加入到混合阴、阳离子交换树脂中，搅拌30 min，抽滤，滤液旋转蒸发除去水分和未反应的甲醛，再于60℃真空干燥10 h得到HOF。
2.3. 在含N-羟甲基甲酰胺的培养基中的培养特性研究
分别配制含HOF的培养基(枯草芽孢杆菌培养用LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，NaCl 10.0 g，水和HOF总量为1000 mL，调节pH至6.8~7.0。啤酒酵母培养用麦芽汁培养基：麦芽膏粉130 g，琼脂20 g，水和HOF总量为1000 mL，自然pH。)。分别取4 mL上述培养基装入10 mL小三角锥瓶中，每个浓度装三瓶，于121℃高压灭菌20 min。分别吸取新制的菌悬液0.04 mL接种到每个小三角锥瓶中，将菌液混合均匀(细菌终浓度约为105 CFU/mL，真菌终浓度约为104 CFU/mL)。接种后，分别取出每个浓度梯度的小三角锥瓶1瓶，与空白做好标记后置于4℃冰箱中；其余2个小三角锥瓶作为平行样置于30℃摇床中培养48 h。定时用紫外分光光度计测定培养液在600 nm的吸光度(A600)，与接种后未培养的培养液及对照组的A600做比较。
2.4. 抑菌实验
配制LB固体培养基，置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min，待培养基冷却至45℃左右，迅速倒入约15 mL培养基于无菌培养皿中，轻轻摇动培养皿，然后平置于台面冷却凝固待用。分别吸取0.1 mL的枯草芽孢杆菌菌悬液加入到上述平板，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀。用镊子将无菌牛津杯(外径为8 mm，内径为6 mm)垂直放于平板标记位置上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入200 μL配好的一定浓度的抑菌液，平放于4℃冰箱2 h后，取出置于30℃培养箱中培养18 h，记录抑菌圈大小。
2.5. 核酸释放实验
为研究HOF对细胞膜的影响，参考文献 [9] 方法进行了核酸释放实验，具体如下：
1) 将培养14 h左右的菌液，分别取4 mL装于无菌离心管，在5000 r/min，常温离心10 min，弃去上清，加入2 mL无菌生理盐水，将细胞吹散，再次离心，洗去残余的培养液，收集菌体。
2) 分别往离心管中加入9 mL HOF和无菌生理盐水，反复吹吸，使菌体分散，分别分装成3管。定时取出3 mL菌液，离心，取上清，测量在260 nm的吸光度(A260)。
3. 结果与讨论
3.1. N-羟甲基甲酰胺的合成
产物的核磁共振谱于室温录谱，NMR化学位移以四甲基硅烷(TMS)为内标，结果如下：1H NMR (400 MHz, D2O) δ: 8.145 (s, 1H, HCO-), 4.810~4.825 (d, 2H, -CH2-); 13C NMR (400 MHz, D2O) δ: 166.101, 70.736, 64.867。分析结果表明，所得产物即为目标产物(图3)。
3.2. 细菌在含N-羟甲基甲酰胺的培养基中的培养特性
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，表现出强抗热、抗化学药物和抗辐射特性 [10]。本论文所采用的枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，研究HOF对其生长和发酵的影响。枯草芽孢杆菌在含HOF溶液的培养基中的培养48 h结果见表1。
Table 1. The effect of HOF on the growth curve of Bacillus subtilis
表1. HOF对枯草芽孢杆菌生长的影响
由表1可见，HOF对枯草芽孢杆菌有显著的抗菌作用。一般认为有机抗菌剂的作用机理可归纳以下3个方面：一是作用于细胞壁和细胞膜系统；二是作用于生化反应酶或其他活性物质；三是作用于遗传物质或遗传微粒结构 [11]。一般认为有机抗菌剂通过渗透和扩散作用，进入细胞内部，使蛋白质变性并导致酶失活，从而达到杀死细菌细胞的作用。可是，我们先前的非水相酶研究发现，HOF作为溶剂，脂肪酶溶于其中表现出很高的酯交换活性，属于生物相容溶剂，不会引起蛋白质变性 [8]。因此有理由推测HOF的抑菌机制为：进入细胞内部后，HOF在酶作用下，分解成甲酰胺和甲醛，既起酰胺类抗菌剂作用，又起醛类抗菌剂作用，从而表现出高的抑菌活性。此外，枯草芽孢杆菌虽然具有很强的向胞外分泌蛋白酶的能力，但蛋白酶的分泌发生在细菌生长周期的对数晚期 [10]，因而HOF的抗菌剂作用不大可能是由于胞外酶作用下分解所致。
酵母对有机物具有一定的耐性，郑晓冬等对10株酵母进行了有机溶剂耐受试验结果发现啤酒酵母比其他酵母抗非极性溶剂的能力更强 [12]。因此，本实验所用菌种为啤酒酵母菌，研究HOF对其生长的影响。啤酒酵母菌在含HOF溶液的培养基中的培养48 h结果见表2。
Table 2. The effect of HOF on the growth curve of Saccharomyces cerivisiae
表2. HOF对啤酒酵母菌生长的影响
由表2可见，HOF对啤酒酵母菌也有显著的抗菌作用。HOF对啤酒酵母菌的最低抑菌浓度介于0.8%~1%之间。
3.3. N-羟甲基甲酰胺的抑菌实验
用牛津杯法研究了HOF对枯草芽孢杆菌的抑菌作用，结果列于表3。
Table 3. The antibacterial activity of HOF
表3. HOF抑菌活性
由表3可见，HOF对枯草芽孢杆菌有显著的抗菌作用，且HOF浓度越高，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果越强，形成的抑菌圈越大。在同样条件下，5%甲酰胺溶液(A)的抑菌圈平均直径为有10.5 mm，常规消毒用的浓度0.25%新洁尔灭(C)的抑菌圈平均直径只有10.0 mm，比HOF(B)的抑菌圈平均直径15.0小(图4)。我们还进行了HOF对啤酒酵母菌的抑菌实验，结果表明HOF对啤酒酵母菌的抑菌作用也强于甲酰胺。可见，HOF有较强的抗菌作用，可望成为新型抗菌剂。
Figure 4. Bacteriostatic diameters to bacteria Bacillus subtilis
图4. 不同抗菌剂对枯草芽胞杆菌的抑菌圈
3.4. 核酸释放实验
病菌细胞壁和细胞膜被破坏后，细胞内核酸的泄露会使细胞外溶液核酸浓度发生变化，在紫外分光光度计的检测下，可以观察到吸光值的变化。枯草芽孢杆菌实验表明，随着时间的增长，HOF和对照组的吸光值变化不大，说明实验过程中，枯草芽孢杆菌维持原有的细胞通透性，可见，HOF对枯草芽孢杆菌的抑菌机制不是作用于细胞壁和细胞膜系统。啤酒酵母菌实验结果见表4。
Table 4. The effect of HOF on DNA relief of Saccharomyces cerivisiae
表4. HOF对酵母菌细胞核酸释放量的影响
由表4可见，随着时间的增长，对照组的吸光值略为增加，而HOF实验组的吸光值上升很快，说明HOF对真菌细胞壁和细胞膜有强破坏作用。因为超声波的物理剪切力和空化作用在短时间内破坏啤酒酵母的细胞结构，促使核酸有效的溶出，我们进行了超声波破壁实验。结合超声波破壁实验数据，不难发现，啤酒酵母菌在蒸馏水和生理盐水中作用24 h后，其吸光值变化不大，但是经超声波破壁后，吸光值增大了3倍左右。可见，啤酒酵母菌在蒸馏水和生理盐水中作用24 h后，其细胞壁和细胞膜系统还是完整的。对照超声波破壁数据，可以发现啤酒酵母菌在HOF中作用24 h后，其细胞壁和细胞膜系统基本上遭到破坏，这可能是HOF对啤酒酵母菌抑菌作用机制之一。
4. 结论
设计并合成了N-羟甲基酰胺亲水抗菌剂，HOF能抑制枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌的生长，有显著的抗菌作用，且HOF浓度越高，抗菌效果越强。在同样条件下，HOF对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母菌的抑菌作用强于甲酰胺。啤酒酵母菌在HOF中作用24 h后，其细胞壁和细胞膜系统基本上遭到破坏，这可能是HOF对啤酒酵母菌抑菌作用机制之一。HOF对枯草芽孢杆菌细胞膜和细胞壁影响不大，其抗菌作用可能是由于HOF在病菌细胞内被酶分解成酰胺和甲醛，起酰胺类抗菌剂和醛类抗菌剂作用，该机制还有待后续实验进一步验证。N-羟甲基酰胺类亲水抗菌剂克服了市售酰胺类抗菌剂水溶性差、醛类抗菌剂易氧化的缺点，可望成为一类环境友好的亲水低毒抗菌剂。
基金项目
本工作得到福建省自然科学基金(2017J01635)资助，特此致谢。
NOTES
*通讯作者。