1. 引言
酒精及其代谢产物乙醛对人体多种器官和系统都有损伤作用，过量饮酒或长期酒精依赖会造成酒精中毒，可造成60多种病变或伤害 [1]。其中，包括对肝脏、中枢神经系统、心脑血管系统、消化系统、生殖系统、内分泌系统、肾脏、骨骼、肌肉的病变或伤害，尤其是对中枢神经系统和肝脏造成的伤害最为严重 [2] [3] [4] [5]。酒精是具有亲脂性的小分子，可透过血脑屏障直接作用于脑部，导致大脑神经组织产生病变，因此酒精对对中枢神经系统损伤较为严重。过量饮酒易导致急性酒精中毒，过量的酒精刺激垂体前叶释放β-内啡肽，作用于神经系统，产生行为意识障碍，表现为言语讷吃、头晕呕吐、视线模糊、嗜睡不醒等症状 [6]。长期酒精依赖会造成慢性酒精中毒，波及大脑皮层、小脑、脑桥和胼胝体等组织，造成中枢神经组织的不可逆病变。肝脏是酒精代谢的主要器官，酒精及其代谢中间产物乙醛对肝脏具有极强的毒性。长期过度饮酒会导致严重的肝脏损伤，引发酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)，临床表现为脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌，严重酗酒可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭 [7]。ALD的发生与酒精及其代谢产物对肝脏细胞的作用，引起的氧化应激和炎症免疫制剂有关 [8]。
蜂花粉不但营养成分丰富而且含有多种生物活性物质，包括蛋白质、酶、氨基酸、碳水化合物、脂类(类胡萝卜素、卵磷脂、甾醇、不饱和脂肪酸等)、酚类(黄酮、苷类等)、维生素、微量元素等 [9]。研究表明，蜂花粉具有改善心血管系统功能、增强免疫力、抗癌防辐射、抗氧化、延缓衰老、防治前列腺疾病等生物活性 [10] [11]。花粉中酚类物质，尤其是黄酮具有显著的清除自由基、抗氧化活性，对多种原因造成的肝损伤具有保护作用 [12]。张会芳等 [13] 研究表明，油菜花粉中的多酚类物质对小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机理可能是油菜花粉中的多酚类化合物具有抗氧化作用，可减少活性氧自由基的产生，减轻氧化应激和炎症反应对肝细胞的损伤。孙丽萍等 [14] [15] 研究表明，油菜蜂花粉及其提取物具有防醉解酒作用，而且可提高血清谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase, GST)水平和谷胱甘肽(Glutathione, GSH)水平，降低甘油三酯(Triglyceride, TG)水平，对ALD具有保护作用。研究发现，益生菌可以通过调节肠道菌群平衡、增强小肠肠道屏障功能、调节免疫抑制炎症、抗氧化作用等机制缓解ALD [16]。利用益生菌对蜂花粉进行发酵，不但具有提高活性成分的含量、避免过敏反应、合成新物质提高利用率、改善口感等优点，而且蜂花粉可以促进益生菌的增殖，从而显著提高功效。本研究利用纳豆芽孢杆菌与乳酸菌发酵油菜蜂花粉，研究其解酒作用及其对ALD的保护作用，以期为进一步开发解酒护肝食品提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
油菜蜂花粉山东华瀚食品有限公司提供；乳酸菌、纳豆芽孢杆菌中国农业科学院蜜蜂研究所提供；56%二锅头北京红星股份有限公司；β-内啡肽(β-EP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨(AST)、乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ADLH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)试剂盒 北京勤邦生物技术有限公司。
实验小鼠(6周龄，25 g左右) 青岛大任富城畜牧有限公司。
2.2. 仪器与设备
MULTISKAN FC酶标仪美国Thermo Fisher Scientific；GL-23M高速冷冻离心机南京昕仪生物科技有限公司；F6-10组织匀浆机南京昕仪生物科技有限公司；BK-FD10S真空冷冻干燥机山东博科生物产业有限公司；LRH-250F生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；NBCT-B超净工作台苏州净化设备有限公司；YXQ-LS.50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
2.3. 实验方法
2.3.1. 动物分组与处理
选取50只小鼠，适应性饲喂一周，随机分为空白对照组、模型组、发酵蜂花粉组、蜂花粉组、益生菌组，每组10只。禁食不禁水12 h后，发酵蜂花粉组、蜂花粉组、益生菌组分别按200 mg/(kg × d)的计量给予相应的药物灌胃，空白对照组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃。30 min后，除空白对照组外各组给予15 mL/kg的56%白酒灌胃处理，空白对照组给予相同体积的生理盐水灌胃处理。灌胃处理1 h后，采用颈椎脱臼法将各组小鼠一半处死，迅速摘取眼球及解剖组织用于生化指标的测定，剩余的小鼠用于小鼠醉酒耐受时间和醒酒时间的测定。
2.3.2. 油菜蜂花粉发酵工艺
油菜蜂花粉辐照灭菌，用无菌水稀释至含水量40%，接种10%的纳豆芽孢杆菌和乳酸菌(1:1)种子液，发酵8 d后，冷冻干燥获得蜂花粉发酵产品。
2.3.3. 小鼠醉酒耐受时间和醒酒时间的测定
各组小鼠白酒及生理盐水灌胃处理，每隔5 min观察小鼠的翻正反射，记录醉酒耐受时间和醒酒时间。
2.3.4. 小鼠脑组织中β-EP的测定
取小鼠脑组织，按照1:9 (W:V)的比例加入生理盐水，用组织匀浆器充分研磨成匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，使用酶联免疫吸附法测定脑组织中β-EP水平。
2.3.5. 小鼠血清ALT和AST活性的测定
小鼠摘眼球取血置于离心管中，3500 r/min离心10 min，取上清液，使用酶联免疫吸附法测定血清中ALT和AST活性。
2.3.6. 小鼠肝脏生化指标的测定
解剖小鼠取肝脏左叶，用生理盐水洗涤除掉血液，按照1:9 (W:V)的比例加入生理盐水，用组织匀浆器充分研磨成匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，使用酶联免疫吸附法测定肝脏中ADH、ADLH、SOD活性以及GSH、MDA含量。
2.3.7. 数据分析
试验数据用平均值 ± 标准误表示，数据统计采用SPSS 22.0软件ANOVA法进行单因子方差分析，用LSD检验进行组间比较，以P < 0.05表示差异统计学意义。
3. 结果与分析
3.1. 发酵蜂花粉对急性酒精中毒小鼠醉酒耐受时间和醒酒时间的影响
判断小鼠是否醉酒以翻正反射消失为标准，给小鼠灌胃白酒后将其翻转，如果小鼠背朝下的姿势能持续保持30 s以上，则认为翻正反射消失，判定为醉酒。灌酒到翻正反射消失的时间为醉酒耐受时间，翻正反射消失到翻正反射恢复的时间为醒酒时间 [17]。从表1可以看出，与模型组小鼠相比，蜂花粉组小鼠的醉酒耐受时间显著延长、醒酒时间显著缩短(P < 0.5)，发酵蜂花粉组小鼠的醉酒耐受时间极显著延长、醒酒时间极显著缩短(P < 0.01)。
Table 1. Effect of different experimental groups on tolerance time and sobriety time of acute alcoholism rats
表1. 不同实验组对急性酒精中毒小鼠醉酒耐受时间和醒酒时间的影响
注：同一列中，相同字母者表示差异未达0.05显著水平。
3.2. 发酵蜂花粉对急性酒精中毒小鼠脑组织中β-EP含量的影响
过量的酒精刺激垂体前叶释放大量的β-EP，与细胞膜上的神经递质受体结合，从而对中枢神经系统产生抑制作用。药物拮抗酒精诱导的脑组织中β-EP水平升高，可认为解除急性酒精中毒的神经抑制机制 [18]。由图1可以看出，模型对照组小鼠脑组织中β-EP活性水平显著提高，与模型组小鼠相比，蜂花粉组小鼠和发酵蜂花粉组小鼠脑组织中β-EP活性水平显著降低(P < 0.05)，说明发酵蜂花粉可以拮抗酒精诱导的脑组织中β-EP水平升高。
(注：相同字母者表示差异未达0.05显著水平)
Figure 1. Effect of different experimental groups on β-EP in brain tissue of rats with acute alcoholism
图1. 不同实验组对对急性酒精中毒小鼠脑组织中β-内啡肽的影响
3.3. 发酵蜂花粉对急性酒精中毒小鼠血清ALT和AST活性的影响
急性肝损伤的肝脏细胞膜完整性受到破坏，导致肝脏中的ALT和AST渗透到血液中。因此，血清中的ALT和AST活性水平是反映肝脏受损的严重程度两个重要指标。由表2可见模型对照组血清ALT和AST活力均显著高于空白对照组(P < 0.05)，表明一次过量饮酒可严重损伤肝功能。相比于模型对照组，发酵蜂花粉组、蜂花粉组和益生菌组小鼠血清中ALT和AST活力均显著降低(P < 0.05)，其中，发酵蜂花粉组小鼠血清中ALT和AST活力降低程度最大，试验结果表明发酵蜂花粉可以有效降低过量饮酒对肝脏造成的伤害。
Table 2. Effect of different experimental groups on alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels in rats serum with acute alcoholism
表2. 不同实验组对对急性酒精中毒小鼠血清ALT和AST活力的影响
3.4. 发酵蜂花粉对急性酒精中毒小鼠肝脏中ADH和ALDH活性的影响
肝脏中ADH和ALDH的活性影响酒精及其代谢中间产物乙醛的代谢速度，较高的ADH和ALDH活性可加快体内酒精及乙醛代谢速度，减轻其对机体的毒害作用。急性酒精中毒的小鼠肝脏中ADH和ALDH的活性逐渐降低。药物如果可提高小鼠肝脏中ADH和ALDH的活性，则可加快体内酒精代谢速度，减轻酒精及乙醛对机体的毒害作用。由图2可见，相比于空白对照组，模型对照组中小鼠肝脏中ADH和ALDH的活性显著降低(P < 0.05)，与模型对照组相比，发酵蜂花粉组小鼠肝脏中ADH和ALDH的活性显著提高。
(注：相同字母者表示差异未达0.05显著水平)
Figure 2. Effect of different experimental groups on ADH and ALDH activity of rats with acute alcoholism
图2. 不同实验组对对急性酒精中毒小鼠肝脏中ADH和ALDH活性的影响
3.5. 发酵蜂花粉对急性酒精中毒小鼠肝脏中抗氧化指标的影响
氧化应激是造成酒精性肝损伤的主要机制之一，急性酒精性中毒导致肝脏内产生大量的活性氧，破坏机体抗氧化防御系统平衡诱发氧化应激机制，导致肝脏中的SOD活性降低、GSH含量减少。MDA是氧化应激导致脂质过氧化的产物之一，其含量水平可以反映肝脏细胞受脂质过氧化反应损伤的程度。由表3可知，与空白对照组相比，模型对照组小鼠肝脏中具有抗氧化功能的SOD和GSH水平显著降低(P < 0.05)，氧化产物MDA含量显著增加(P < 0.05)，表明酒精暴露导致小鼠肝脏抗氧化能力下降，可引起小鼠肝脏氧化损伤。与模型对照组相比，发酵蜂花粉组、蜂花粉组和益生菌组能显著提高SOD和GSH水平(P < 0.05)，显著降低MDA含量(P < 0.05)，其中发酵蜂花粉效果最显著，发酵蜂花粉能把SOD水平提高到和空白对照组无显著差异。
Table 3. Effect of different experimental groups on SOD activity and GSH, MDA levels in rats liver with acute alcoholism
表3. 不同实验组对对急性酒精中毒小鼠肝脏SOD活力和GSH、MDA水平的影响
4. 结论
长久以来，酒文化一直是世界文化的重要组成部分，对世界文化进程起着重要的作用。随着社会的发展，人们越来越意识到酒精泛滥会影响人体健康甚至产生一系列的社会问题 [19] [20]。研究表明，每年约有300多万人因酒精相关原因死亡，酒精中毒被认为是世界范围内的第一公害 [21]。《2018全球酒精与健康报告》中数据显示，全球范围内酒的消费量逐渐下降，但是在西太平洋地区尤其是中国酒的消费量仍呈上升趋势，而且人均消费量也高于世界平均水平 [22]。
人体摄入酒精后，有少量酒精在胃内被胃粘膜上被氧化成乙醛参与代谢。大部分酒精会被胃和小肠吸收后进入血液循环，聚集到血液和人体组织中，被氧化为乙醛参与代谢清除，其中以肝脏组织代谢最多。另有少部分酒精会通过非氧化代谢途径，被脂肪酸乙酯合成酶催化生产脂肪酸乙酯参与代谢 [23]。酒精的代谢过程涉及到酶、及代谢产物，这些酶及代谢产物的水平变化会影响酒精的代谢和对组织的损伤。
本实验测定了急性酒精中毒小鼠翻正反射消失、恢复时间以及脑组织中β-EP水平，结果显示发酵蜂花粉组小鼠的醉酒耐受时间极显著延长、醒酒时间极显著缩短(P < 0.01)，益生菌发酵蜂花粉可降低急性酒精中毒小鼠脑组织中β-EP水平(P < 0.05)，说明益生菌发酵蜂花粉具有很好的解酒作用。测定了急性酒精中毒小鼠血清ALT和AST活性，结果显示急性酒精中毒小鼠血清ALT和AST活性显著上升(P < 0.05)，益生菌发酵蜂花粉可显著降低性酒精中毒小鼠血清ALT和AST活性(P < 0.05)，说明一次过量饮酒可破坏肝脏细胞膜完整性，从而损伤肝功能，益生菌发酵蜂花粉可降低过量饮酒对肝脏造成的伤害。测定了急性酒精中毒小鼠肝脏抗氧化指标，结果益生菌发酵蜂花粉可提高急性酒精中毒小鼠肝脏ADH、ADLH、SOD活性，提高GSH水平、降低MDA水平，说明益生菌发酵蜂花粉具有抗氧化活性，可通过抑制氧化应激改善急性酒精中毒对肝脏造成的伤害。
NOTES
*第一作者。