1. 引言
糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见和最典型的微血管并发症，是中国成年人失明或严重丧失视力的主要原因[1]。国际糖尿病联合会(IDF)预计糖尿病的流行率预计将从2019年的4.63亿增加到2045年的7亿，占全球成年人口的10%，其中2.45亿成年人将患有DR [2]。DR已成为不容忽视的公共卫生问题。2002年，有报道称29%的糖尿病患者发展为DR，而22%有糖尿病史的个体没有发展成DR。然而，DR的发病机制尚未明确，临床治疗有限。目前认为，DR的发病为神经退行性病变和微血管改变为主。高血糖诱导的DR发病机制与4种主要的发生变化有关：多元醇途径激活、晚期糖基化终产物(AGEs)增加、蛋白激酶C激活和氨基己糖途径的诱导[3] [4]。因此，发现新的生物标志物，对预测DR疾病进展及提供治疗靶点有重要的作用。
miRNA是约22个核苷酸的非编码RNA，通过沉默RNA调节生物网络，在物种间广泛分布，研究已经确定，miRNA可以参与细胞生长、凋亡、纤维化、肥大和变老。2002年，Calin等人首次证实了miRNA在慢性淋巴细胞性白血病中的作用，随后报道了几种与疾病相关的失调miRNA，如癌症[5]、糖尿病[6]和心血管疾病[7]。miRNA在DR发病机制中的作用已被证实[8]，Kovacs等人已经对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的视网膜进行了大型miRNA表达谱分析[9]。最近的研究报道了miR-34a在HG诱导的视网膜上皮细胞中高表达，miR-34a的上调显着抑制了视网膜上皮细胞的细胞增殖和迁移[10]。在DR大鼠模型中miR-34a沉默通过抑制VEGF表达来减轻DR [11]。但是miR-34a在DR疾病进展及预测的作用尚不明确。血清中循环的miRNA经过验证后，可作为疾病诊断或患者分层的有用生物标志物。出于道德原因，健康人不能作为对照，因此关于DR患者玻璃体表达谱的信息并不多。
迄今为止，DR进展的确切机制仍然大部分未知，并且对DR生物标志物的可靠性存在有限的共识。因此，在我们的研究中，我们的目标是评估DR患者玻璃体液中miR-34a-5p的表达，并分析miR-34a-5p是否可以作为鉴别DR的生物标志物。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
1) 收集2023年10月至2024年2月安徽医科大学第二附属医院PDR患者共5例，特发性黄斑裂孔患者5例(对照组)。本研究通过我院医院伦理委员会审查，所有受试者均知情同意。
2) 入组标准：根据中国2型糖尿病防治指南标准确诊为T2DM [12]；DR患者均由同一位眼底病专业及具有丰富经验的医生进行诊断诊断与分期；DR诊断与分期满足中华医学会眼科学会眼底病学组通过的DR临床诊疗指南(2014年)标准[13]。
3) 排除标准：(1) 排除合并视网膜静脉阻塞，视神经疾患等其它诊断患有眼底疾病的患者；(2) 排除合并自身免疫相关性眼病如葡萄膜炎的患者；(3) 排除其它影响糖代谢疾病如甲状腺功能亢进、肢端肥大症、库欣综合征合并患者；(4) 排除其它患有炎症疾病患者如乙型肝炎感染，艾滋病患者；(5) 排除合并全身其它严重疾病，如近三月脑梗病史，心肌梗死、中风病史患者；(6) 排除患有血液系统疾病患者，透析或肾移植患者；(7) 排除合并免疫系统疾病，如强直性脊柱炎，痛风患者；(8) 排除近三个月有外伤手术史及感染；(9) 排除合并恶性肿瘤患者。
2.2. 方法
2.2.1. 玻璃体液采集
在PDR患者的玻璃体切割术开启输注和开始玻璃体切除术之前，用玻璃体切割器获得未稀释的玻璃体标本0.5 ml。用1000 rpm离心10 min，去除细胞碎片，取上清转移到无酶ep管中，送到−80℃超低温冰箱保存，直到检测。对照组样本以类似的方式从因特发性黄斑裂孔的患者中获得。所有操作2小时内完成。
2.2.2. RNA的提取和逆转录
根据液体样品说明书，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen，加利福尼亚，美国)从200 μl血清和玻璃液中提取总RNA，包括miRNA。最终洗脱体积为20 μl。在样本中加入了人工合成cel-miR-39-3p作为miR-34a-5p的外参。用南京诺唯赞生物科技公司miRNA 1st Strand cDNA Synthesis逆转录试剂盒对miR-34a-5p及外参cel-miR-39-3p进行逆转录。所有引物由从北京擎科科技有限公司设计，引物序列见表1。
2.2.3. 实时聚合酶链式反应检测miR-34a-5p
应用南京诺唯赞生物科技公司miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix, ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行qPCR反应，初始变性温度为95℃/5 min (miRNA)或95℃/30 sec (circRNA)，变性温度为95℃/10 sec，退火温度为60℃/30 sec，在最后一个反应周期后，以95℃/15秒、60℃/60秒、95℃/15秒的熔融曲线完成反应。每个反应一式三份。用2-ΔΔCT方程计算RNA的相对含量。所有引物均从北京擎科科技有限公司，引物序列见表1。
Table 1. Primer sequence
表1. 引物序列
引物 |
序列 |
miR-34a-5p |
|
RT |
5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAACC-3’ |
Forward |
5’-GGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3’ |
U6 |
|
Forward |
5’-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3’ |
Reverse |
5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTG3’ |
2.2.4. 统计学分析
所有数据均采用GraphPad Prism 8进行分析作图。结果以平均值 ± SD值显示。采用单因素方差分析及χ2检验比较受试者的临床资料。采用独立样本t检验分析玻璃体液中miRNA的表达差异。P < 0.05具有统计学意义。利用ROC曲线确定基因表达最高灵敏度和特异度作为区分不同分类的预测指标的临界点。所有统计学均用SPSS 26.0进行分析。
3. 结果
3.1. 临床资料的比较
本研究共纳入10例受试者，其中PDR患者5例，特发性黄斑裂孔患者(对照组) 5例。表2显示了本研究所有入组受试者的特征。糖尿病患者和对照组在年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、甘油三脂、高密度脂蛋白方面没有显著差异，糖尿病组患者糖化血红蛋白、空腹血糖、餐后2 h血糖、胆固醇及低密度脂蛋白均高于对照组，且P < 0.05，具有统计学意义。
Table 2. Demographic and clinical characteristics
表2. 人口统计资料和临床特征
|
NC (5) |
PDR (5) |
P值 |
年龄/岁 |
72.20 ± 5.02 |
73.20 ± 3.56 |
0.5232 |
BMI (体重/身高2) |
24.28 ± 2.38 |
22.79 ± 3.15 |
0.6049 |
性别n (%) |
|
|
1 |
男性 |
3(60) |
3(60) |
|
女性 |
2(40) |
2(40) |
|
收缩压(mmHg) |
117.00 ± 20.93 |
152.20 ± 39.56 |
0.2451 |
舒张压(mmHg) |
68.00 ± 9.51 |
69.40 ± 14.28 |
0.4511 |
糖化血红蛋白(%) |
5.12 ± 0.33 |
8.96 ± 1.28 |
0.0215 |
空腹血糖(mg/dl) |
4.53 ± 0.53 |
7.97 ± 2.43 |
0.0120 |
2 hpp (mg/dl) |
4.80 ± 1.02 |
16.20 ± 3.94 |
0.0226 |
胆固醇(mmol/L) |
3.98 ± 0.87 |
6.22 ± 2.85 |
0.0414 |
甘油三脂(mmol/L) |
1.76 ± 1.38 |
1.54 ± 0.68 |
0.2036 |
低密度脂蛋白(mmol/L) |
2.02 ± 0.56 |
3.77 ± 2.18 |
0.0217 |
高密度脂蛋白(mmol/L) |
1.39 ± 0.34 |
2.11 ± 0.33 |
0.9589 |
3.2. 玻璃液中miR-34a-5p的表达
应用qRT-PCR分析NC组和PDR组玻璃体液中miR-34a-5p的表达水平。NC组玻璃液中miR-34a-5p水平低于PDR组(图1)。NC组玻璃液中miR-34a-5p水平是1.39 ± 0.86，低于PDR组(8.44 ± 6.14)，P值小于0.05 (表3)。
Figure 1. Expression of miR-34a-5p in vitreous body fluids
图1. 玻璃体液中miR-34a-5p的表达量
Table 3. Expression of miR-34a-5p in vitreous body fluids
表3. 玻璃液中miR-34a-5p的表达量
|
NC |
PDR |
P |
miR-34a-5p |
1.39 ± 0.86 |
8.44 ± 6.14 |
0.0345 |
3.3. 玻璃体液中miR-34a-5p的鉴别诊断价值
我们检测了玻璃体液中miR-34a-5p水平是否可以区分NC组和PDR。我们的结果表明，miR-34a-5p可以区分NC和PDR，ROC曲线的AUC为0.9600 (95% CI = 0.8427~1.000)，p = 0.0163。在临界值2.162时，检测到敏感性为100%和特异性80% (表4和图2)。
Figure 2. ROC curve of miR-34a-5p in vitreous body fluids
图2. 玻璃体液中miR-34a-5p ROC曲线
Table 4. ROC curve analysis of miR-34a in vitreous body fluids of control group and PDR group
表4. 玻璃体液中对照组与PDR组miR-34a的ROC曲线分析
|
|
AU (95% CI) |
P值 |
临界值 |
灵敏度% |
特异度% |
约登指数 |
miR-34a-5p |
玻璃体液 |
0.9600 (0.8427~1.000) |
0.0163 |
2.162 |
100 |
80 |
0.8 |
4. 讨论
糖尿病视网膜病是2型糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一。在全球疾病负担研究发现，在50岁及以上的成年人中，DR是导致失明和中重度视力损害的第五大原因。糖尿病眼病导致的年龄标准化失明全球患病率从1990年14.9%增加到2020年18.5%。随着全球人口迅速老龄化，糖尿病患者寿命延长，生活方式改变导致糖尿病风险增加，预计糖尿病视网膜病负担将增加[14]。然而，糖尿病视网膜病的发生机制尚不明确，临床治疗糖尿病视网膜病手段有限。糖尿病视网膜病按严重程度分为非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)和增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)。NPDR的特点是微动脉瘤、视网膜内出血点、硬渗出物、棉绒斑和静脉扩张。PDR会导致各种严重的晚期病变引起严重的后果如玻璃体出血、视网膜脱落等[15]。临床上治疗这些严重的晚期并发症只能采取玻璃体切除手术治疗。因此，寻找糖尿病视网膜病的早期生物标志物和治疗靶标，尤其是对延缓NPDR发展成PDR尤为重要。
近些年来，非编码RNA (ncRNA)在在糖尿病视网膜病中的作用逐渐被发现[16]。ncRNA调节涉及细胞凋亡、炎症反应、视觉感知和光转导因子，并且在糖尿病视网膜病不同时期ncRNA水平也随之发生改变。目前研究有很多miRNA在糖尿病视网膜病进展中发挥重要作用[17]，有文献报道miR-34a-5p参与调节糖尿病视网膜病进展，然而尚未有证据表明miR-34a-5p在不同时期糖尿病视网膜病患者体液中的变化。
本研究共纳入10例受试者，其中PDR患者5例，特发性黄斑裂孔患者(对照组) 5例。收集本研究所有入组受试者的特征。我们发现糖尿病患者和对照组在年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、甘油三脂、高密度脂蛋白方面没有显著差异，糖尿病组患者糖化血红蛋白、空腹血糖、餐后2 h血糖、胆固醇及低密度脂蛋白均高于对照组且P < 0.05，具有统计学意义。结果提示我们处理血糖引起糖尿病视网膜病发展，胆固醇也是糖尿病视网膜病发生的危险因素之一。
本研究我们共收集了10例患者的玻璃体液，我们发现在PDR患者玻璃体中miR-34a-5p的表达明显高于对照组(特发性黄斑裂孔患者)，对照组组玻璃液中miR-34a-5p水平是1.39 ± 0.86，低于PDR组(8.44 ± 6.14)，P值小于0.05。结果表明miR-34a-5p在糖尿病视网膜病眼内玻璃体液中表达增加，可能为糖尿病视网膜病新的治疗靶标。
通过ROC曲线分析，我们发现了miR-34a-5p在玻璃体液中的诊断阈值。在玻璃体液中，当miR-34a-5p含量高于2.162时，患PDR的风险增加；在PDR这一阶段，内皮细胞损伤最严重，因此，早期发现PDR这是糖尿病视网膜病早期干预的关键。
本研究抽取玻璃体液为特发性黄斑裂孔患者行玻璃体切除术前收取，并不是真正意义上的健康对照。由于时间比较短，收取患者数目较少，玻璃液各组只有5例，因此，本研究仅仅属于小样本的初步探索。今后应当扩大样本量并且进行深入的机制探索以明确miR-34a-5p在糖尿病视网膜病中的具体作用机制。现有的研究结果表明miR-34a-5p可能与糖尿病视网膜病的发病机制有关，有望成为糖尿病视网膜病新的生物标志物和治疗靶点。
基金项目
安徽省重点研究与开发计划项目(No.202004j07020029)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。