磷酸盐对盐生杜氏藻生长和细胞色素积累的影响

Effects of Phosphate on the Growth and Cell Pigment Accumulation of Dunaliella salina

摘要: 研究了不同浓度(0~0.30 mmol/L)的KH₂PO₄对盐生杜氏藻生长和细胞色素积累的影响，结果表明，添加0.10 mmol/L KH₂PO₄，细胞生长最快，最高密度为153 × 10⁴ cell/mL，无磷对照组密度最低，仅为36 × 104 cell/mL；KH₂PO₄浓度为0.20 mmol/L时，β-胡萝卜素积累量最高，为12.8 mg/L，其次是0.15 mmol/L，对照组很低，仅为6.28 mg/L，KH₂PO₄超过0.25 mmol/L对β-胡萝卜素积累有抑制作用；适当添加KH₂PO₄对D. salina叶绿素a合成有促进作用；在培养的前6天，pH值明显上升，随后4~5天又下降；添加0.1 mmol/L KH₂PO₄细胞蛋白质含量最高，为37.34%，对照组仅为24.86%；0.10 mmol/L组的KH₂PO₄在6天内吸收完毕，KH₂PO₄吸收的时间与其最初的浓度呈正相关关系，建立了藻液中KH₂PO₄被盐生杜氏藻吸收的动力学方程。

Abstract: The effects of KH₂PO₄ with different levels on the growth and cell pigment accumulation of Dunaliel-la salina were investigated and the results indicated that the maximum growth of 153 × 104 cell/mL was detected in culture medium with 0.1 mmol/L KH₂PO₄ and the minimum of 36 × 104 cell/mL in the control group. The culture medium with 0.20 mmol/L KH₂PO₄ had the highest β-carotene con-tent of 12.8 mg/L, followed by 11.04 mg/L with 0.15 mmol/L KH₂PO₄, and the control group had lower β-carotene content of only 6.28 mg/L. Over 0.25 mmol/L KH₂PO₄ was found to have depress-ing function to cell growth. Right level KH₂PO₄ was helpful to chlorophyll a biosynthesis. During the first 6 days within culture period, pH values of the culture media rose up, and then declined in the following 4 - 5 days. The cells which were cultured in media with 0.10 mmol/L KH₂PO₄ had the high-est protein content of 37.34%, while the control group only had 24.86%; 0.10 mmol/L KH₂PO₄ was assimilated completely within 6 days, and the uptake time had right-relationship with KH₂PO₄ con-tents. Finally, the assimilated mechanic equation of KH₂PO₄ by D. salina was set up.

1. 引言

β-胡萝卜素具有猝灭人体自由基、延缓衰老、抑制肿瘤转化及抗癌等生物活性功能 [1] ，因而受到广泛瞩目。盐生杜氏藻Dunaliella salina在一定培养条件下能大量积累β-胡萝卜素，最高可达细胞干重的14% [2] 。目前，澳大利亚、以色列、美国、中国、日本、西班牙、加拿大等国家已有几十家公司从事杜氏藻生产，杜氏藻产品的市场仍在日益扩大 [3] 。我国具有漫长的海岸线和星罗棋布的内陆盐湖，具有培养杜氏藻生产β-胡萝卜素得天独厚的自然条件。营养盐为影响杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累的重要环境因子之一。明确杜氏藻对磷盐的吸收规律及杜氏藻生长阶段和β-胡萝卜素积累阶段对磷盐种类和浓度的不同要求对优化杜氏藻培养基配方、提高杜氏藻及β-胡萝卜素产量、降低养殖成本有重要的参考价值。

2. 材料与方法

2.1. 藻种

盐生杜氏藻北京1号(Dunaliella salina Beijing 1)，由内蒙古兰太集团生物公司提供。

2.2. 培养条件

2.2.1. 卤水

饱和卤水取自内蒙古兰太盐湖，盐度356，比重1.09，pH 6.03。用蒸馏水稀释至盐度120。

2.2.2. 营养盐

一次性添加NH₄NO₃ 0.4 mmol/L，尿素0.20 mmol/L，柠檬酸铁0.01 mmol/L，NaHCO₃3.0 mmol/L，KH₂PO₄添加量为0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mmol/L，并设无磷组为对照。

2.2.3. 温度

空调控温，25℃± 1℃。

2.2.4. 光照

日光灯管照明，光强3200 lux，光/暗周期为16 h/8 h。

2.2.5. 其它

250 mL三角烧瓶，取对数生长期藻种接种，接种密度2.0 × 10⁴ cell/mL。每天摇瓶6次，实验设三个平行样，重复两次。

2.3. 测定指标和测定方法

2.3.1. 细胞计数

血球计数板法计数，每天一次。

2.3.2. β-胡萝卜素的测定 [4]

培养至12天时测定。

5 mL藻液(加入少量碳酸镁)→90%丙酮萃取→上清液→90%丙酮定容至50 mL→721分光光度计测ＯD₄₅₀值

β-胡萝卜素含量(mg/L) = (定容体积 ´ 10 ´ OD₄₅₀) ´ 1000 ÷ (2500 ´ 取样体积)

式中体积单位均为毫升(mL)，测定叶绿素a时同。

2.3.3. 叶绿素a的测定 [4]

培养至7天时测定。

5 mL藻液(加入少量碳酸镁)→90%丙酮萃取→上清液→90%丙酮定容至50 mL→721分光光度计测OD₆₆₃、OD₆₄₅值。

叶绿素含量(mg/L) = (8.02 ´ OD₆₆₃ +20.21 ´ OD₆₄₅) ´ 定容体积 ÷ 取样体积

2.3.4. pH值

用Orion Model 828型酸度计测定，每天一次。

2.3.5. 蛋白质测定

培养至12天时，取藻液500 mL，离心，蒸馏水冲洗藻泥，再离心，重复3次，冷冻干燥。取干藻粉0.1~0.2 g，凯氏定氮法测定蛋白质含量。

2.3.6. 脂肪酸测定 [4]

取冷冻干燥的样品0.1 g，经皂化、甲酯化，萃取，气相色谱仪(HP-5890型)测定脂肪酸组分。按峰面积归一化法计算脂肪酸组分百分含量。

2.3.7. KH₂PO₄浓度测定 [4]

取藻液5 mL，离心，取上清液，按Murphy和Riley所提供的方法测培养液中残存的KH₂PO₄的浓度，每天一次。

2.4. 数据处理

采用SPSS软件包对结果进行统计分析，以0.05作为差异显著性水平。

3. 结果

3.1. KH₂PO₄对D. salina细胞生长的影响

KH₂PO₄对D. salina细胞生长的影响见图1。从图1可见，添加0.10 mmol/L KH₂PO₄藻液中的细胞生长最快，最高密度为153 × 10⁴ cell/mL，而KH₂PO₄浓度超过0.20 mmol/L对细胞的生长和分裂有抑制作用。无磷对照组的细胞密度最低，仅为36 × 10⁴ cell/mL (p < 0.05)，说明适当添加KH₂PO₄对D. salina生长有促进作用。

3.2. KH₂PO₄对D. salina β-胡萝卜素积累的影响

KH₂PO₄对D. salina β-胡萝卜素积累的影响见图2。从图2可以看出，β-胡萝卜素积累最适宜的KH₂PO₄浓度是0.20 mmol/L，藻液β-胡萝卜素最大值为12.8 mg/L，KH₂PO₄超过2.50 mmol/L对β-胡萝卜素的合成有抑制作用。无磷对照组的β-胡萝卜素含量较低，仅为6.28 mg/L (p < 0.05)。可见适量添加KH₂PO₄可以促进β-胡萝卜素的合成。

Figure 1. Effect of KH₂PO₄ on the growth of D. salina

图1. KH₂PO₄对D. salina生长的影响

Figure 2. Effect of KH₂PO₄ on the biosynthesis of β-carotene in D. salina

图2. KH₂PO₄对D. salina β-胡萝卜素积累的影响

3.3. KH₂PO₄对D. salina叶绿素a合成的影响

KH₂PO₄对D. salina叶绿素a合成的影响见图3。从图3可见，浓度为0.25 mmol/L时，藻液中叶绿素a产量最高；而KH₂PO₄浓度为0.30 mmol/L的藻液的叶绿素a含量很低，说明太高的KH₂PO₄不利于叶绿素a的合成。值得注意的是，无磷对照组的叶绿素含量最低，说明适量KH₂PO₄对D. salina叶绿素a合成有促进作用。

3.4. KH₂PO₄对D. salina藻液pH值的影响

KH₂PO₄对D. salina藻液pH值的影响见图4。从图4可看出，在培养的前6天，pH值有一个明显上升趋势，随后4~5天在波动中下降。但无磷对照组pH值的变化不符合这个规律，pH值总体水平较低。

3.5. KH₂PO₄对D. salina细胞蛋白质含量的影响

KH₂PO₄对D. salina细胞蛋白质含量的影响见表1。表1显示，培养基中添加KH₂PO₄ 0.1 mmol/L时，细胞中蛋白质含量最高，为37.34%；对照组蛋白含量最低，为24.86%，且处理组与对照组差异均显著(p < 0.05)，说明在实验范围内，较低的KH₂PO₄有利于细胞内蛋白质的合成。

Figure 3. Effect of KH₂PO₄ on biosynthesis of chlorophyll a in D. salina

图3. KH₂PO₄对D. salina叶绿素a的影响

Figure 4. Effect of KH₂PO₄ on pH values of the D. salina media

图4. KH₂PO₄对D. salina藻液pH值的影响

3.6. KH₂PO₄对D. salina脂肪酸组成的影响

表2显示了KH₂PO₄对D. salina脂肪酸组成的影响，可见D. salina脂肪酸主要由16:0、18:1和18:2 ω-6组成，0.25 mmol/L组的总脂肪酸含量(82.60 ± 13.67%)是最高的，与对照组(70.26 ± 10.41%)有显著差异(p < 0.05)。

3.7. D. salina对KH₂PO₄的吸收规律

D. salina对KH₂PO₄的吸收规律见图5。从图5可见，最初溶液中KH₂PO₄的浓度越高，其残存时间越长，即KH₂PO₄在培养液中残存的时间与其最初的施用浓度呈正相关关系；最初5天磷的消耗较快，这是最初几天藻细胞生长、分裂迅速，光合作用旺盛的结果。

Table 1. Effect of KH2PO4 on the contents of cell protein in D. salina

表1. KH₂PO₄浓度对D. salina细胞蛋白质含量的影响

*表示与对照组差异显著(p < 0.05)。

Table 2. Effects of KH2PO4 on the fatty acid composition of D. salina

表2. KH₂PO₄对D. salina脂肪酸组成的影响(占总脂肪酸的百分比)

带*者表示与对照组差异显著(p < 0.05)。

Figure 5. Absorption patterns of KH₂PO₄ by D. salina

图5. 杜氏藻对KH₂PO₄吸收的情况

用数学模型拟合KH₂PO₄浓度为0.2 mmol/L藻液中KH₂PO₄的残存量和培养时间的关系，可得如下函数：

其中x为培养时间(天)，y为藻液中残存的KH₂PO₄浓度(mmol/L)。

相关系数R² = 0.9603，大于0.90，说明该方程较好地反映了D. salina对KH₂PO₄的吸收规律。

4. 讨论

N、P盐种类、浓度及其比例、温度、光照、盐度、pH值等对杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累都有重要影响 [5] 。本研究表明，0.10 mmol/LKH₂PO₄有助于杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累，但浓度超过0.20 mmol/L对细胞生长和β-胡萝卜素积累有抑制作用，且浓度越高，抑制作用越大。研究普遍认为，P、N饥饿或不足有利于β-胡萝卜素积累 [6] 。本研究结果也证实P的缺乏有助于单细胞β-胡萝卜素大量合成。笔者另一项研究表明，N缺乏不利于细胞生长，但有助于β-胡萝卜素积累，这与其他学者研究结果是一致的 [6] 。杜氏藻生长阶段和β-胡萝卜素积累阶段对光照、温度、营养盐、盐度等环境因子要求显著不同 [7] 。生长阶段要求高的营养盐浓度，而β-胡萝卜素积累阶段需要很低的营养盐浓度甚至是0。据此，Amotz et al. (1997)提出了杜氏藻生产的二阶段养殖法 [8] ，即先用较低的盐度和光照及较高的氮盐条件使藻增殖至较理想密度，再提高盐度和光照胁迫β-胡萝卜素积累。姜建国等研究表明，[N]/[P]比为15时，杜氏藻生长最好 [9] 。结合大生产的经验，我们认为培养基中添0.10 mmol/L KH₂PO₄对D. salina生长和β-胡萝卜素积累是较合适的。

培养过程的前6天，pH值有明显上升趋势，随后4~5天有一个下降。第4~6天是细胞分裂最旺盛的时间，这期间细胞的快速分裂、生长和旺盛的光合作用、大量消耗CO₂正好与pH值的明显上升从时间上相吻合。不难推断，第1~6天pH值的上升是这期间细胞旺盛的分裂、生长和光合作用的结果。对于随后几天pH值的下降，Hirsch et al.认为，随着密度升高，细胞分泌一些酸性物质抑制细胞继续分裂，大量死亡的细胞也可能向藻液释放酸性物质，从而导致pH值下降 [10] 。本研究发现β-胡萝卜素大量积累的开始与pH值的下降在时间上是吻合的，由此推测β-胡萝卜素的合成是D. salina对细胞高度密集、分泌物大增、pH值上升等不良环境适应的结果。Amotz (1996)研究认为，pH值控制在8.0~8.5对杜氏藻生长和β-胡萝卜素积累比较合适 [11] 。pH升高不利于藻类继续生长和β-胡萝卜素的积累，生产上大多采用通入CO₂的办法加以解决，既能降低pH值，又能补充碳源。

基金项目

国家863计划项目(863- 819-04-10 )；临沂大学博士科研启动基金资助项目(BS07004)。