FAK/PI3K/AKt/mTOR信号通路相关蛋白在胃癌中的表达及意义

The Expression and Significance of FAK/PI3K/AKt/mTOR Signaling Pathway Related Proteins in Human Gastric Carcinoma

摘要: 目的：探讨FAK、PI3K、AKT、mTOR蛋白在胃癌组织中表达与临床病理及生存的关系。方法：应用免疫组化的方法检测50例胃癌组织、48例癌旁组织、20例正常胃组织中FAK、PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达。结果：FAK、p-AKt、p-mTOR在胃癌组织中的表达高于癌旁组织、正常胃组织(P < 0.01)，其表达水平与浸润深度、临床分期、淋巴结转移呈正相关(P < 0.01, r = 0.81)，与组织分化类型呈负相关(P < 0.01, r = −0.85)，与患者的性别、年龄、胃癌的部位无相关(P > 0.05)；PI3K在胃癌组织中的表达高于癌旁组织、正常胃组织(P > 0.05)，其表达水平与患者的性别、年龄、胃癌的部位、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无相关(P > 0.05)；生存分析显示，p-AKt、p-mTOR阳性表达与阴性表达患者的生存时间比较差异有统计意义(P < 0.01)；FAK、PI3K阳性表达与阴性表达患者的生存时间比较差异无统计意义(P > 0.05)。结论：AKT、mTOR的异常表达参与了胃癌的演进过程，可能是胃癌患者预后的一个独立指标之一。

Abstract: Object: To explore the relationship between the expression of FAK, PI3K, AKt and mTOR protein in gastric carcinoma and analyze the relationship with clinicopathology and survival. Methods: Im-munohistochemical method was used to detect the level of FAK, PI3K, p-AKt and p-mTOR protein in 50 cases of gastric carcinoma, 48 cases of tissue adjacent to carcinoma and 20 normal gastric tissues. Result: The level of FAK, p-AKt and p-mTOR in gastric cancer carcinoma was higher than that of tissue adjacent to carcinoma and normal gastric tissues (p < 0.01), its level was positively correlated with infiltration depth, clinical stage, lymph node metastasis (P < 0.01), and negatively correlated with the type of tissue differentiation (P < 0.01), was not correlated with the gender, age and gastric carcinoma area of patients ((P > 0.05); the level of PI3K in gastric carcinoma was higher than that of tissue adjacent to carcinoma and normal gastric tissue (P > 0.05), and the level was not correlated with the patient's gender, gastric carcinoma area, infiltration depth, clinical stage and lymph node metastasis (P > 0.05). Survival analysis shows, the survival time of patients with p-AKt, p-mTOR positive expression and negative expression was statistically significant (p < 0.01), and with FAK, PI3K negative expression was not statistically significant. Conclusion: The abnormal expression of AKt and mTOR is involved in the evolution of gastric carcinoma, which may be one of the independent indexes of prognosis of gastric carcinoma patients.

1. 引言

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，病死率居恶性肿瘤的第3位，在我国，胃癌病人占世界胃癌病人的比例超过43% [1] ，5年生存率只有30%~40% [2] [3] ，如何有效地控制胃癌的发生、发展已经成为我国重要的健康问题。胃癌的治疗以手术为主，辅以化疗、放疗、分子靶向药物、生物抗体治疗等，但多数胃癌患者就诊时已属进展期，失去手术的机会，且目前疗效已经进入瓶颈期。胃癌的发生与饮食 [4] 、幽门螺杆菌的感染 [5] 、遗传、抑癌基因的失活、促癌基因的活化、RhoA信号转导通路等的异常 [6] 相关。对于胃癌发病机制的信号通路的研究相对滞后，缺乏治疗的靶点，评价预后的生物标志物较少。本项目研究的目的在于分析FAK/PI3K/AKt/mTOR (粘附斑激酶/磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶Ｂ/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，focal adhesion kinse/phosphoinositide 3 kinase/proteion kinase B/the mammalian target of rapamycin, FAK/PI3K/AKt/mTOR)信号通路相关蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中表达的差异，与病理分型、病理分级、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、总生存期的相关性，进而探索研究AFK/PI3K/AKt/mTOR信号通路相关蛋白与胃癌临床病理学特征、预后的相关性，探讨胃癌的发生、发展机制，阐明胃癌靶向治疗的靶点，为胃癌的靶向治疗提供实验依据，寻找评价胃癌预后的分子标志物，进一步指导临床治疗。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

随机收集2010年1月至2010年12月齐齐哈尔市第一医院行手术切除并经病理证实、 临床资料完整的胃癌石蜡标本50例，癌旁组织48例，正常胃组织20例，术前均未行放化疗。男性36例，女性14 例，年龄34~82岁，中位年龄64岁，≤60岁23例，>60岁27例。术后所制切片由专职病理科医生进行复检，标本组织学类型以世界卫生组织(WHO)分类2000标准。组织分化程度：低分化腺癌20例，中分化腺癌24例，高分化腺癌6例；病灶部位：贲门部癌1例，胃底部癌1例，胃体部癌19例，幽门部癌29；浸润深度：未穿透浆膜层(T1 + T2) 13例，穿透浆膜层(T3 + T4)：37例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移31例。根据美国癌症联合会(AJCC) 2010年第7版为准进行肿瘤分期(TNM分期)，I期17例，II期26例，III期4，IV期3例。通过医院伦理委员会批准。

2.2. 方法

兔抗人FAK、p-AKT、PI3K、p-mTOR、FAK单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；生物素标记山羊抗兔(Ⅱ抗)、辣根酶标记的链霉卵白素工作液、山羊血清封闭液、DAB-显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.2.1. 免疫组织化学法

检测胃癌组织、癌旁组织(距离肿瘤组织5.0 cm)、正常胃组织中FAK、PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达。免疫组化采用S-P二步法进行，按照免疫组化试剂盒说明书进行。

2.2.2. 免疫组织化学结果判读

通过显微镜对染色结果进行判断，首先将低倍镜下的染色情况拍摄下来，被染色为棕黄色或者是棕褐色的细胞为阳性，进行判定时采用 的评价方法是综合评分方法。标准如下:按照切片着色深浅进行评分，棕褐色为3分，棕黄色2分，浅黄色1分，无着色0分；按照阳性细胞比例 进行评分，比例在76%~100%之间为4分，在51%~75%之间为3分，26%~50%之间为2分，1%~25%之间为1分，总比例小于1%为0分。将两种评分标准所得分数相加即为调查分数，总得分为在5分以上为强阳性，总得分在2~4分之间为弱阳性，总得分在1分以下为阴性 [7] 。

2.3. 统计学处理

采用SPSS统计软件进行处理．采用卡方检验进行相关性分析、Kaplan-Meier方法进行生存期分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. FAK、PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中的表达

FAK蛋白主要表达于细胞浆，在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织的表达率分别为68%、14.95%、25%，P < 0.01，胃癌组织与癌旁组织、正常胃组织比较，p < 0.01，差异有统计学意义，癌旁组织与正常胃组织比较，p > 0.05，差异无统计学意义；PI3K蛋白主要表达于细胞膜，在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织的表达率分别为28%、18.75%、10%，胃癌组织与癌旁组织、正常胃组织比较，P > 0.05，差异无统计学意义；p-AKT蛋白主要表达于细胞膜，在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织的表达率分别为70%、25%、5%，胃癌组织与癌旁组织、正常胃组织比较P < 0.01，差异有统计学意义，癌旁组织与正常胃组织比较，p > 0.05，差异无统计学意义；义p-mTOR蛋白主要表达于细胞浆，在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织的表达率分别为54%、18.55%、0%，胃癌组织与癌旁组织、正常胃组织，P < 0.01，差异有统计学意义，癌旁组织与正常组织比较，p < 0.05，差异有统计学意义，见表1、图1~图4。

Figure 1. FAK expression in gastric cancer tissues, adjacent tissue and normal gastric tissues (×200). (A): Gastric cancer tissues; (B): Adjacent tissue; (C): Normal gastric tissues; (D) Negative control

图1. FAK蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中表达(×200)。(A) 胃癌组织；(B) 癌旁组织；(C) 正常胃组织；(D) 阴性对照

Figure 2. PI3K expression in gastric cancer tissues, adjacent tissue and normal gastric tissues (×200). (A): Gastric cancer tissues; (B): Adjacent tissue; (C): Normal gastric tissues; (D) Negative control

图2. PI3K蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中表达(×200)。(A) 胃癌组织；(B) 癌旁组织；(C) 正常胃组织；(D) 阴性对照

Figure 3. p-AKT expression in gastric cancer tissues, adjacent tissue and normal gastric tissues(×200). (A): Gastric cancer tissues; (B): Adjacent tissue; (C): Normal gastric tissues; (D) Negative control

图3. p-AKT蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中表达(×200)。(A) 胃癌组织；(B) 癌旁组织；(C) 正常胃组织；(D) 阴性对照

Table 1. FAK, PI3K, p-AKT, p-mTOR expression in gastric cancer tissues, adjacent tissue and normal gastric tissues

表1. FAK、PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中的表达

^*与癌旁组织比较P < 0.01；^#与正常组织比较P < 0.01；^&与正常组织比较P < 0.01。

3.2. FAK、PI3K、p-AKT、p-mTOR表达与胃癌病理特征的关系

FAK、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达与浸润深度、临床分期、淋巴结转移呈正相关，与组织分化类型呈负相关，与胃癌患者的性别、年龄、胃癌的部位之间差异无统计学意义；PI3K蛋白的表达与胃癌患者的性别、年龄、胃癌的部位、浸润深度、临床分期、淋巴结转移之间差异无统计学意p > 0.05，见表2。

Figure 4. p-mTOR expression in gastric cancer tissues, adjacent tissue and normal gastric tissues(×200). (A) GASTRIC cancer tissues; (B) adjacent tissue; (C) Normal gastric tissues; (D) Negative control

图4. p-mTOR蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中表达(×200)。(A) 胃癌组织；(B) 癌旁组织；(C) 正常胃组织；(D) 阴性对照

Table 2. Relationship between the expression of FAK, PI3K, p-AKt, p-mTOR and the pathological characteristics of gastric cancer (*p < 0.05, **P < 0.01)

表2. FAK、PI3K、p-AKt、p-mTOR表达与胃癌病理特征的关系（^*p < 0.05, ^**P < 0.01）

^*P < 0.05，^**P < 0.01。

3.3. FAK、PI3K、p-AKt、p-mTOR表达与胃癌生存时间的关系

FAK、PI3K、p-AKt、p-mTOR阳性表达患者的平均生存时间分别是39.8、58.6、26.3、29.8个月，阴性表达患者的平均生存时间分别是49.8、48.7、58.2、53.7个月，经过Log Rank统计学检验，p-AKt、p-mTOR阳性表达与阴性表达患者的生存时间比较差异有统计意义p < 0.05，见图5~图8。

Figure 5. Relationship between FAK expression and survival time (1 positive, 2, negative)

图5. FAK表达与生存时间的关系(1阳性2，阴性)

Figure 6. Relationship between PI3K expression and survival time (1 positive, 2 negative)

图6. PI3K表达与生存时间的关系(1阳性，2阴性)

Figure 7. Relationship between p-AKt expression and survival time (1 positive, 2 negative)

图7. p-AKt表达与生存时间的关系(1阳性，2阴性)

Figure 8. Relationship between m-TOR expression and survival time (1 positive, 2 negative)

图8. m-TOR表达与生存时间的关系(1阳性，2阴性)

4. 讨论

FAK/PI3K/AKt/mTOR信号通路与人类肿瘤发生、发展密切相关 [8] 。FAK是一种胞质非受体酪氨酸激酶，为整合素信号通路中的关键分子，又与细胞粘附密切相关，在细胞的迁移、粘附和浸润等方面起着至关重要的作用。FAK参与了肿瘤细胞的多个信号途径的传导，可以将细胞外的信号经整合素及生长因子受体传导至细胞内。研究成果表明，FAK能通过PI3K/Akt途径与mTOR信号通路关联，促进细胞骨架的重建、粘着斑的形成和更新以及细胞表面基质金属蛋白酶的表达等作用与肿瘤细胞的迁移和浸润密切相关，促进肿瘤转移，且PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活已经在脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有报道，FAK/PI3K/AKt/mTOR信号通路在胃癌发生、发展、治疗以及预后中作用未见报道。本课题回顾性分析了FAK/PI3K/AKt/mTOR信号通路相关蛋白在胃癌组织、癌旁组织、正常胃组织中的表达与胃癌病理特征、生存的关系。研究结果表明，FAK、p-AKt、p-mTOR在胃癌组织中的表达高于癌旁组织、正常胃组织(P < 0.01)，其表达水平与浸润深度、临床分期、淋巴结转移呈正相关(P < 0.01)，与组织分化类型呈负相关(P < 0.01)，与患者的性别、年龄、胃癌的部位无相关(P > 0.05)；PI3K在胃癌组织中的表达高于癌旁组织、正常胃组织(P > 0.05)，其表达水平与患者的性别、年龄、胃癌的部位、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无相关(P > 0.05)；生存分析显示，p-AKt、p-mTOR阳性表达与阴性表达患者的生存时间比较差异有统计意义(P < 0.01)；FAK、PI3K阳性表达与阴性表达患者的生存时间比较差异无统计意义(P > 0.05)。据上述结果分析，p-AKt、p-mTOR阳性表达的胃癌可能更具有侵袭及转移的潜能，有望成为胃癌判断预后的指标之一，指导临床诊疗。

基金项目

黑龙江省齐齐哈尔市社会发展攻关，项目编号：SFGG-201571。

NOTES

^*通讯作者。