1. 引言
墨鱼干是新鲜墨鱼经过剖割、除内脏、洗涤、出晒、整形、罨蒸发花和包装等工序制成的墨鱼制品。在超市销售的袋装或散装墨鱼干表面都常见有白色斑块。通常认为白斑形成是罨蒸发花工序的结果，它使七成干的鱼肉内部水分向外扩张，体内甜菜碱等氮素化合物析出干燥而成白粉状附着物 [1] 。令人感兴趣的是白斑的形态与微生物菌群形成的生物膜非常相似，因而在开展大学生创新开放实验时，对市售墨鱼干白斑中的耐盐细菌进行了分离鉴定研究。曾经从墨鱼干产品的表面白斑中分离到中度耐盐细菌——栖盐菌属细菌(Salinicola sp. NYJ01) [2] 。本研究从表面白斑中分离纯化出另一株中度耐盐菌株NYJ2，检测了该菌株的细胞形态学、部分生理生化指标，并进行了16S rDNA测序和系统发育分析，以及生长繁殖抑制性试验。研究结果有助于人们了解墨鱼干产品表面菌群的分布情况，为墨鱼干产品的质量控制提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
实验采样：市售袋装墨鱼干，表面有白斑；牛肉膏蛋白胨培养基(含5% NaCl)：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 50 g、去离子水1000 mL，pH 7.2~7.4，115℃灭菌30 min。
磁珠法细菌基因组DNA抽提试剂盒，Taq DNA多聚酶(含Taq DNA Polymerase、10× PCR Buffer和MgCl2)，细菌通用引物27F和1492R，dNTPs Mixture Solution：生工生物工程(上海)股份有限公司；稳压稳流电泳仪(SCR-600A，中国上海康华生化仪器制造厂)； PCR扩增仪(Eppendorf AG 22331 Hamburg，德国Eppendorf AG公司)；倒置荧光显微镜(Leica DMi8，德国Leica 公司)。
2.2. 试验方法
2.2.1. 耐盐菌的分离纯化
取袋装的墨鱼干一片，用无菌手术刀刮取表面白斑碎屑约1 g，转接到牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中，于25℃恒温振荡箱中150 r/min培养24 h，富集培养耐盐细菌；适度稀释菌悬液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板(5% NaCl)，28℃恒温箱中倒置培养48 h；继续用接种环挑取单菌落划线分离纯化，得到耐盐细菌NYJ2。
2.2.2. 菌株NYJ2的形态学检测
挑取牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中NYJ2培养物制作细菌涂片，石炭酸复红染料染色后，使用倒置荧光显微镜观察菌体细胞形态。
2.2.3. 耐盐度测定试验
用牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中25℃恒温150 r/min振荡培养24 h的NYJ2培养物，按1%接种量(V/V)接种于100 ml含NaCl浓度(W/V)为0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%和32%的牛肉膏蛋白胨培养液，25℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h，观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况，评判菌体细胞的生长耐盐性。
2.2.4. 生长温度范围试验
用牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中25℃恒温150 r/min振荡培养24 h的NYJ2培养物，按1%接种量(V/V)接种于100 ml牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中，分别在10℃、25℃、37℃、42℃、46℃和55℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h，观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况，评判菌体细胞的生长温度适应性。
2.2.5. 生长pH范围试验
用NaOH(或HCl)试剂调整牛肉膏蛋白胨液体培养液(含5% NaCl)的pH值。将新鲜NYJ2培养物按1%接种量(V/V)接种于100 ml pH值为4、5、6、7、8、9的牛肉膏蛋白胨培养液中，25℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h，观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况，评判菌体细胞的生长pH适应性。
2.2.6. 16S rDNA序列分析
移取菌株NYJ2的牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)培养物，离心(10,000×g, 10 min)收集菌体细胞。用磁珠法细菌DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，以1.0%琼脂糖电泳检测所提取的基因组DNA质量。以合适的PCR反应体系和反应条件 [2] ，用通用引物27F和1429R扩增得到菌株16S rDNA 的PCR产物，经琼脂糖电泳检测质量后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司双向测序。测定的16S rDNA序列拼接后，在GenBank中用blastN程序搜索比对相似序列。并将序列提交到GenBank中。
利用LPSN数据库检索枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)和芽胞杆菌属(Bacillus)的菌种名和模式菌株，查找到部分菌株的16S rDNA序列在Genbank中的登录号，用于菌株NYJ2的系统发育分析。选择建树用枝芽胞杆菌的特征是：1) 分离自中国的盐湖海洋等自然环境；2) 分离自传统发酵食品基质；或3) 在含0%~20%的NaCl盐度下能生长的耐盐菌。分析菌株NYJ2的系统发育地位时，首先运用ClustalW 1.8.3程序将所选模式菌株与待测菌株NYJ2的16S rDNA序列进行多序列比对；其次运用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0.26构建N-J系统发育树。系统发育树的可靠性检测的自举值设定为1000次，以枯草芽胞杆菌做外群。
2.2.7. 对食品防腐添加剂抗性试验
参照国家标准 [3] 规定在水产或肉制品中容许使用的防腐添加剂的种类及其最大容许剂量，防腐添加剂选用食品级的山梨酸钠、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、双乙酸钠、焦亚硫酸钠和乳酸链球菌素。在100 ml牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)中分别添加前述食品防腐添加剂至最大溶剂容许量和对倍稀释剂量，移取牛肉膏蛋白胨培养液(含5% NaCl)培养的NYJ2的新鲜培养物，按1%接种量(V/V)接种后，25℃恒温150 r/min振荡培养24~72 h，观察培养物的浊度以衡量菌体细胞的生长状况，检测防腐添加剂对菌株NYJ2最小抑制浓度。
3. 结果与讨论
3.1. 结果分析
3.1.1. 菌株的形态
从墨鱼干样品中分离纯化到耐盐菌株NYJ2，它在牛肉膏蛋白胨培养基(5% NaCl)平板上，28℃培养48 h生长形成的菌落呈乳白色、隆起、边缘整齐。在牛肉膏蛋白胨培养液(5% NaCl)中28℃恒温振荡培养48 h，在室温下静置半小时可见培养液底部出现絮凝状物。显微镜镜检细菌涂片观察到菌体细胞呈杆状或短杆状。
3.1.2. 菌株NYJ2的生长条件
耐盐度测定结果是菌株NYJ2在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液均可生长繁殖，其中1%~10% NaCl生长良好。在无NaCl和高于15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中未见生长。表明菌株NYJ2是一种中度嗜盐菌。
生长温度范围试验结果是菌株NYJ2在10℃、25℃、37℃、42℃、46℃试验点下可生长繁殖，其中25℃~42℃生长最好，55℃未见生长。
生长pH范围试验结果是菌株NYJ2在pH 5~8范围内均可生长繁殖，而在pH 4和pH 9时未见生长。
3.1.3. 16S rDNA序列分析
提取NYJ2的基因组DNA后，进行16S rDNA部分序列PCR扩增，PCR产物测序得1490 bp核苷酸片段，在Genbank中提交的登录号是KT149393。序列在Genbank中进行BLAST搜索比对，结果表明它与枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)和芽胞杆菌属(Bacillus)中的部分菌株的16S rRNA基因序列的一致性高达98%。选择枝芽胞杆菌属中的一些模式菌株与待测菌株NYJ2的16S rRNA基因序列构建系统发育树(见图1)，菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属的模式株盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)聚类在同一分枝，表明两者之间的亲缘关系最近。因此，鉴定NYJ2是一种枝芽胞杆菌，暂定名为Virgibacillus sp. NYJ2。
3.1.4. 食品防腐添加剂抗性试验
试验结果见表1。在最大容许剂量下，山梨酸钠(0.1%)、苯甲酸钠(0.1%)、双乙酸钠(0.1%)、脱氢乙酸钠(0.05%)和焦亚硫酸钠(0.01%)都不能抑制菌株NYJ2生长繁殖。只有0.05%的乳酸链球菌素有抑制该菌生长繁殖的效果。
3.2. 讨论
本研究表明枝芽胞杆菌与墨鱼干表面白斑的形成有一定关系，它对产品安全性或品质影响应引人关注。根据文献资料 [4] 整理得到枝芽胞杆菌属的一些模式菌株的生物学特性见表2，表明枝芽胞杆菌属菌株所分离的环境主要是含高盐环境：如盐田、盐湖或者高盐食品环境。枝芽胞杆菌属菌种能在含盐(NaCl等)浓度范围较宽的培养基中，是一类典型的耐盐细菌(/嗜盐细菌)。由此可见，枝芽胞杆菌适应生长在水活度较低的基质上，墨鱼干无疑是该菌的良好生长基质。
研究人员对枝芽胞杆菌属在食品中的生态分布持乐观的评价。枝芽胞杆菌属能够促进食品发酵的进程以及改善发酵食品的风味，如韩国的发酵酱(Jeotgal) [5] 和中国四川的川冬菜 [6] 的发酵生产，还作为发酵剂缩短鱼露 [7] 的发酵时间。该属细菌还能产生有激酶活性的盐诱导性肽 [8] ；以及各种酶系，甚至有抗微生物物质 [9] ；还合成相容性溶质四氢甲基嘧啶羧酸(Ectoine) [10] ，它可作为渗透压调节因子，在生物医药中有应用前景 [11] 。或许枝芽胞杆菌能用做发酵剂用于墨鱼干的罨蒸发花工序，而有益于产品的风味和品质。如果人们对墨鱼干制品中的枝芽胞杆菌菌斑有所介意，可利用0.05%的乳酸链球菌素来抑制菌株NYJ2的生长繁殖。
Figure 1. Neighbor-joining phylogenetic consensus tree based on the 16S rRNA gene partial sequences
图1. 基于16S rRNA基因构建的N-J系统发育树
Table 1. The effects of food additive preservative on growth and reproduction of the strain NYJ2
表1. 食品防腐添加剂对菌株NYJ2生长繁殖的影响
注：“-”表示培养液澄清，无菌生长；“+”表示培养液微浑浊菌已生长；“++”表示培养液浑浊，菌明显生长。
Table 2. The contrast of growth characteristics of several type strains belonging to the genus Virgibacillus and the strain NYJ2
表2. 菌株NYJ2与枝芽胞杆菌属部分模式菌株的生长特性的比较
4. 结论
从市售墨鱼干表面白斑分离纯化出一株耐盐细菌NYJ2。通过细胞形态特征、部分生理生化特性、16S rDNA测序和系统发育分析表明它是一种枝芽胞杆菌(Virgibacillus sp. NYJ2)，是一种中度嗜盐菌，在含0.5%~15% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中可生长，最适1%~10% NaCl；生长酸碱度范围是pH 5~8；生长温度范围是10℃~46℃，最适25℃~42℃；可利用10℃以下低温，或者用0.05%乳酸链球菌素抑制其生长繁殖。
基金项目
湖南省教育厅资助科研项目(16B095)；湖南科技大学大学生科研创新计划项目(SYZ2015081, SYZ2018065)。
NOTES
*通讯作者。